Meest Waarschijnlijke Aantal (MPN): hoe het werkt, hoe je de tabellen leest en wanneer je het verkiest boven de plaattelling

Tellen zonder kolonies te zien

De plaattelling telt wat zichtbaar is: elke kolonie op de agar geldt als één kolonievormende eenheid, zoals wordt uitgelegd in wat kve zijn en hoe je ze interpreteert. De methode van het Meest Waarschijnlijke Aantal (MPN, naar de Engelse afkorting) komt langs een andere weg tot een getal. Ze telt geen kolonies: ze verdeelt het monster over meerdere buizen met bouillon, kijkt in welke buizen groei optreedt en berekent uit die combinatie van positieve en negatieve buizen de concentratie die dat resultaat het waarschijnlijkst heeft opgeleverd.

Appendix 2 van het Bacteriological Analytical Manual (BAM) van de FDA schrijft de eerste nauwkeurige schatting van levensvatbare bacteriën via deze weg toe aan McCrady, in 1915. De methode is nog steeds actueel omdat ze situaties oplost waarin de plaat tekortschiet: lage concentraties, levensmiddelen met deeltjes die op kolonies lijken en micro-organismen die een ophoping nodig hebben voordat ze geïsoleerd kunnen worden.

Het statistische principe

Het idee is zo ver te verdunnen dat sommige buizen ten minste één levensvatbare cel krijgen en andere geen enkele. Als de bacteriën willekeurig verdeeld zijn, volgt het aantal cellen per buis een Poissonverdeling, en de kans dat een buis zonder cellen blijft, hangt alleen af van de concentratie en van de hoeveelheid geënt monster. Met meerdere decimale verdunningen en meerdere buizen per verdunning maakt het patroon van positieve buizen het mogelijk de oorspronkelijke concentratie te schatten. Het MPN is letterlijk de concentratiewaarde die het waargenomen resultaat het waarschijnlijkst maakt; de vergelijking wordt iteratief opgelost.

De aannames waaraan moet worden voldaan

Het BAM noemt vier voorwaarden voor een geldige schatting:

• De bacteriën zijn willekeurig over het monster verdeeld.
• Ze liggen los van elkaar, niet in groepjes, en stoten elkaar niet af.
• Elke buis die ook maar één levensvatbaar organisme ontvangt, vertoont groei of een detecteerbare verandering.
• De buizen zijn onafhankelijk van elkaar.

De derde aanname is het veeleisendst: het medium moet één enkele, soms beschadigde cel laten groeien tegenover de begeleidende flora. Daarom bepaalt de kwaliteit van de bouillon en van de ophopingsstap rechtstreeks het resultaat. Bovendien telt het MPN alleen levensvatbare organismen. Als de bacteriën ketens of groepjes vormen die de verdunning niet scheidt, geeft het BAM aan dat het resultaat moet worden gelezen als groei-eenheden of kve, niet als afzonderlijke cellen.

Reeksen van 3, 5 en 10 buizen

Het meest gepubliceerde ontwerp bestaat uit drie opeenvolgende decimale verdunningen met elk 3, 5, 8 of 10 buizen; Appendix 2 bevat tabellen voor die ontwerpen, opgesteld voor entvolumes van 0,1, 0,01 en 0,001 g. Hoofdstuk 4 van het BAM, over coliformen en E. coli, geeft aan dat de reeks van 3 buizen voor de meeste levensmiddelen wordt gebruikt; dat bij tweekleppige weekdieren niet minder dan 5 buizen per verdunning mogen worden gebruikt; en dat er een methode met 10 buizen bestaat voor flessenwater of monsters waarvan geen sterke besmetting wordt verwacht.

Meer buizen betekent meer informatie per verdunning en dus smallere intervallen en een lagere ondergrens. Met de BAM-tabellen en entvolumes van 0,1, 0,01 en 0,001 g wordt een resultaat waarbij alle buizen negatief zijn, gerapporteerd als minder dan 3,0 MPN/g in de reeks van 3 buizen en als minder dan 1,8 MPN/g in die van 5 buizen. De bovengrens van het betrouwbaarheidsinterval van dat nulresultaat daalt van 9,5 naar 6,8 en, met 10 buizen, naar 3,1 MPN/g.

Hoe je de tabellen leest

Het resultaat wordt uitgedrukt als een code van drie cijfers: het aantal positieve buizen in elk van de drie gekozen verdunningen. In de tabel voor 3 buizen komt de code 3-1-0 overeen met 43 MPN/g, met een 95 %-betrouwbaarheidsinterval van 9 tot 180. Waren de gebruikte entvolumes tien keer kleiner dan die van de tabel (0,01, 0,001 en 0,0001 g), dan worden de waarde en de grenzen met 10 vermenigvuldigd: 430 MPN/g. Dezelfde regel werkt ook omlaag: grotere hoeveelheden enten verlaagt de bepalingsgrens.

Wanneer meer dan drie verdunningen worden geënt, beschrijft het BAM een procedure om de drie te kiezen die in de tabel worden opgezocht. Kort gezegd vallen de hoogste verdunningen af die samen met de voorgaande alleen negatieve buizen hebben, en wordt gezocht naar de hoogste verdunning met uitsluitend positieve buizen. De FDA biedt daarnaast een rekenapplicatie en een spreadsheet om verdunningen te selecteren.

De tabellen laten combinaties weg die zo onwaarschijnlijk zijn dat ze op een laboratoriumfout of contaminatie wijzen. Staat de verkregen code niet in de tabel, dan behandelt het BAM die als een onwaarschijnlijk resultaat: het kan te wijten zijn aan interferentie in de lage verdunningen of aan het bevestigen van te weinig kolonies, en als de oorzaak onbekend is, is de schatting mogelijk niet betrouwbaar.

Betrouwbaarheidsintervallen: het getal komt met een brede marge

Een MPN moet altijd samen met het interval worden gelezen. In de reeks van 5 buizen geeft de code 5-2-0 49 MPN/g, met een 95 %-interval van 15 tot 150: de werkelijke waarde kan liggen in een bereik dat bijna een factor tien omvat. Het BAM definieert dat interval als volgt: vóór het enten van de buizen is de kans dat het resulterende interval de werkelijke concentratie bevat ten minste 95 %. De tabellen gebruiken een aangepaste versie van de methode van de Man (1983); de Excel-spreadsheet van de FDA gebruikt een normale benadering van de logaritme van het MPN, zodat de intervallen daarvan kunnen afwijken van die in de tabellen.

Verschillende auteurs hebben beschreven dat het MPN de concentratie doorgaans overschat. Het BAM verwijst naar het werk van Garthright (1993), dat aantoonde dat die vertekening niet noemenswaardig is wanneer de resultaten in logaritmen worden uitgedrukt, de gebruikelijke manier om gegevens te vergelijken en te combineren. Hoe onzekerheid, detectiegrens en conformiteitsbeslissing samenhangen, lees je in detectiegrens en meetonzekerheid.

Waar het MPN in de levensmiddelenindustrie wordt gebruikt

Coliformen en E. coli in levensmiddelen

De klassieke BAM-methode kent drie fasen. In de vermoedelijke fase worden de verdunningen geënt in laurylsulfaat-tryptosebouillon (LST) en geïncubeerd bij 35 °C; gasvorming wordt na 24 en na 48 uur genoteerd. In de bevestigende fase voor coliformen gaat elke buis met gas naar briljantgroen-gal-lactosebouillon (BGLB) bij 35 °C, en voor fecale coliformen en E. coli naar EC-bouillon bij 44,5 °C. De volledige fase voor E. coli voegt isolatie op L-EMB-agar en biochemische tests (IMViC) toe. Het MPN wordt berekend met het aandeel bevestigde buizen in drie opeenvolgende verdunningen. Het hoofdstuk herinnert eraan dat coliform geen taxonomische categorie is, maar een werkdefinitie. Wat elke groep in water aangeeft, wordt uitgelegd in totale coliformen, E. coli en enterococcen.

E. coli in tweekleppige weekdieren: ISO 16649-3

Dit is het geval waarin het MPN de methode is die de norm voorschrijft. Verordening (EG) nr. 2073/2005 stelt voor levende tweekleppige weekdieren, en voor levende stekelhuidigen, manteldieren en mariene buikpotigen, een voedselveiligheidscriterium voor E. coli vast met n = 5, c = 1, m = 230 en M = 700 MPN per 100 g vlees en intervalvair vocht, gedurende de houdbaarheidstermijn, met EN/ISO 16649-3 als referentiemethode. De partij is bevredigend als alle vijf waarden 230 of minder zijn, of als er slechts één tussen 230 en 700 ligt.

Het generieke protocol van het FAO-referentiecentrum, gebaseerd op ISO 16649-3, beschrijft de methode als een tweestaps-MPN met 5 buizen en 3 verdunningen. Eerst wordt het homogenaat van de weekdieren geënt in gemodificeerde mineralen-glutamaatbouillon en 24 uur bij 37 °C geïncubeerd; daarna worden de buizen met zuurvorming overgeënt op agar met een chromogeen β-glucuronidasesubstraat (TBX) bij 44 °C. De theoretische detectiegrens is 18 E. coli per 100 g, en met drie verdunningen is het hoogste rapporteerbare resultaat groter dan 18.000. β-glucuronidasenegatieve stammen, zoals E. coli O157, worden niet gedetecteerd. Hetzelfde document vermeldt dat Codex-norm 292-2008 deze methode, of een gelijkwaardige, aanwijst voor levende of rauwe tweekleppige weekdieren.

Kwantitatieve Salmonella in karkassen en nekhuid

Voor Salmonella beantwoordt de detectie (afwezigheid in 25 g) of de ziekteverwekker aanwezig is; het MPN beantwoordt hoeveel er is. De technische specificatie ISO/TS 6579-2:2012 beschrijft een geminiaturiseerd MPN in platen met 12 putjes: drie putjes per verdunning, opeenvolgende verdunningen in gebufferd peptonwater en overenten op het halfvaste medium MSRV bij 41,5 °C, met bevestiging op XLD-agar. De norm erkent haar beperking: de detectiegrens is ongeveer 1 kve/g, tegenover 1 kve in 25 g (0,04 kve/g) bij de detectiemethode, en ze is niet geschikt voor monsters met minder dan 1 kve/g, waarvoor ze een conventioneel MPN aanbeveelt.

Een studie die in 2024 in Poultry Science werd gepubliceerd, paste dit geminiaturiseerde MPN toe op 96 samengestelde nekhuidmonsters, die 480 kippenkarkassen vertegenwoordigden. Ze vond Salmonella in 97,9 % van de monsters vóór het koelen en in 85,4 % daarna, met gemiddelde tellingen van 1,84 en 1,48 log MPN/g. Een aanwezigheidsresultaat had die afname niet laten zien. Dit soort kwantificering dient om processtappen te beoordelen, zoals te zien is in Salmonella in kippenvlees.

Listeria monocytogenes in positieve monsters

Hoofdstuk 10 van het BAM vraagt om L. monocytogenes te tellen wanneer een levensmiddel positief test, met een reserveportie en een combinatie van MPN en directe uitplating. Het MPN wordt opgezet met 50 g monster in 450 ml gebufferde Listeria-ophopingsbouillon (BLEB) en vier verdunningen met elk drie buizen, overeenkomend met 10, 1, 0,1 en 0,01 g monster. Na 48 uur wordt elke buis uitgeplaat voor isolatie en bevestiging, of gescreend met een goedgekeurde snelle methode waarna de vermoedelijke positieven worden bevestigd; het resultaat wordt geïnterpreteerd met de tabellen van Appendix 2. Zijn alle buizen positief, dan geldt de telling via directe uitplating.

MPN versus plaattelling (kve)

Het zijn geen concurrenten, maar instrumenten voor verschillende bereiken en matrices:

• Gevoeligheid bij lage aantallen. Het BAM wijst erop dat het MPN bijzonder nuttig is voor lage concentraties, onder 100 per gram, vooral in melk en water. Elke buis kan meerdere grammen ontvangen, wat de ondergrens verlaagt.
• Lastige matrices. Bij levensmiddelen met deeltjes die de koloniételling verstoren, omzeilt de buis met bouillon het probleem om kolonies van voedselresten te onderscheiden.
• Herstel van beschadigde cellen. De bouillon werkt als een voorafgaande groeistap, wat cellen die door hitte, kou of desinfectiemiddelen gestrest zijn bevoordeelt, mits het medium geschikt is.
• Precisie. Dat is het zwakke punt: de MPN-intervallen zijn breed, zodat twee resultaten die verschillend lijken statistisch niet hoeven te verschillen. Een goed getelde plaat binnen haar bruikbare bereik is doorgaans nauwkeuriger.
• Werk en tijd. Veel buizen, meerdere overentingen en bevestigingen van 48 uur of langer. De traditionele kweek op plaat is directer als de verwachte belasting hoog is.
• Bevestiging. Bij methoden voor ziekteverwekkers is een buis met groei vermoedelijk positief tot ze is bevestigd (zie presumptief versus bevestigd resultaat).

Welke TAAG-kits met deze methode samenhangen

TAAG heeft geen MPN-kit: de realtime PCR-kits zijn kwalitatief (detectie en identificatie) en leveren geen aantal micro-organismen per gram op. Waar ze wel een rol kunnen spelen, is bij het aflezen van buizen of putjes, zoals hoofdstuk 10 van het BAM toestaat voor het Listeria-MPN. De catalogus bevat kits voor de micro-organismen die met MPN worden gekwantificeerd: Specio 1.3 E. coli (V-SF167), met opgegeven matrices voor levensmiddelen, dranken en levende en inerte oppervlakken; Ampliora 1.3 E. coli (V-SF69), voor bladgroenten en oppervlakken; Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97), met een opgegeven gevoeligheid van 1 kve/25 g in rauwe kippendij, diepvriesrundvleesburger, worst (longanicilla), mortadella en oppervlak; en Ampliora 2.3 Listeria spp. and L. monocytogenes (V-SF46), voor levensmiddelen, dranken en oppervlakken. Geen ervan vermeldt tweekleppige weekdieren als gevalideerde matrix, en de bijbehorende ophopingsmedia zijn niet de bouillons van een genormaliseerd MPN (MMGM, BLEB of MSRV). Een kit gebruiken om buizen van een MPN af te lezen, vereist dat dit gebruik wordt gevalideerd met de concrete bouillon en matrix; bespreek het met TAAG voordat je het in een procedure opneemt.