Lees vóór dit artikel bij voorkeur eerst hoe PCR in de microbiologie werkt.
Wat is multiplex-PCR?
Traditionele PCR (of “simplex”) amplificeert en detecteert één genetisch doelwit per reactie: één buisje, één micro-organisme. Multiplex-PCR combineert meerdere sets primers en probes — elk gemerkt met een andere fluorofoor — in dezelfde reactie, waardoor meerdere micro-organismen of genen in één buisje en één run kunnen worden geïdentificeerd.
Hoe onderscheidt het de doelwitten van elkaar?
Elke probe geeft fluorescentie in een ander kleurkanaal (FAM, HEX, ROX, Cy5 en andere), zodat het PCR-apparaat meerdere signalen tegelijk kan uitlezen en de software elk signaal aan het bijbehorende micro-organisme toewijst. De praktische grens ligt niet bij het aantal micro-organismen dat men wil zoeken, maar bij het aantal fluorescentiekanalen dat het apparaat kan uitlezen en het aantal primers dat in dezelfde reactie naast elkaar kan bestaan zonder elkaar te storen.
Voordelen ten opzichte van meerdere enkelvoudige PCR's
Minder tijd en minder monster
In plaats van een monster over meerdere buisjes te verdelen om afzonderlijk Salmonella, Listeria en E. coli te zoeken, levert één multiplexbepaling de drie resultaten tegelijk, wat monstervolume, reagentia en analistentijd bespaart.
Minder variatie tussen resultaten
Doordat dezelfde doelwitten in dezelfde reactie en onder dezelfde omstandigheden worden geanalyseerd, neemt het risico af op variatie die ontstaat bij het vergelijken van resultaten uit afzonderlijke buisjes en runs.
Beperkingen en ontwerpoverwegingen
Een betrouwbare multiplexbepaling ontwerpen is complexer dan een enkelvoudige: de primers van het ene doelwit kunnen die van het andere storen (primerdimeren), en te veel doelwitten toevoegen kan de gevoeligheid van elk afzonderlijk verminderen. Daarom is het ontwerpen van een multiplexpanel — wat combineer je en in welke verhouding — op zichzelf gespecialiseerd optimalisatiewerk, dat steeds vaker met computationele ontwerptools wordt ondersteund.
Waar wordt het gebruikt in de levensmiddelenindustrie?
Het is vooral waardevol in gecombineerde pathogenenpanels (bijvoorbeeld Salmonella + Listeria + E. coli O157:H7 + S. aureus in één bepaling) en in bederfpanels die gelijktijdig zuurminnende bacteriën, gisten en schimmels in dranken opsporen.
Conclusie
Multiplex-PCR lost een heel concreet probleem van de industriële microbiologie op: hoeveel micro-organismen moeten worden gezocht en hoeveel tijd en monster dat kost. Meerdere doelwitten in één reactie combineren versnelt de vrijgavebeslissing, mits het panel goed is ontworpen.
Over TAAG
Ontdek hoe de multiplexpanels van TAAG pathogenen en bederforganismen in één moleculair werkproces combineren.
Veelgestelde vragen
Is een multiplexbepaling minder gevoelig dan een enkelvoudige?
Dat kan, als het ontwerp niet goed geoptimaliseerd is, omdat de verschillende primers om dezelfde reagentia concurreren; een goed multiplexontwerp beperkt dat gevoeligheidsverlies.
Hoeveel micro-organismen kan één multiplexpanel aantonen?
Dat hangt af van apparaat en ontwerp; typische industriële panels combineren 2 tot 5 doelwitten per reactie, al kunnen smeltcurvetechnologieën er tientallen in één buisje identificeren.
Vervangt multiplex-PCR de traditionele kweekpanels?
In veel werkprocessen wel, voor snelle screening; traditionele kweek blijft doorgaans behouden als bevestiging wanneer het regelgevende kader dat eist.