Onderdeel van de pijler fundamenten en standaardisatie van het TAAG Leercentrum. Vult de gids over AOAC-PTM-certificering en die over traditionele microbiologische kweek aan.
Inhoudsopgave
Twee verschillende vragen over dezelfde methode
Voordat een laboratorium een microbiologische methode in routine gebruikt, moet het twee vragen beantwoorden. De eerste is of de methode werkt: of ze het doelmicro-organisme met aanvaardbare prestaties aantoont of kwantificeert ten opzichte van een erkende referentie. De tweede is of ze werkt in zijn handen, met zijn personeel, zijn apparatuur en de levensmiddelen die het dagelijks analyseert. De eerste vraag wordt beantwoord door de validatie; de tweede door de verificatie.
Het onderscheid is geen technisch detail. De norm ISO/IEC 17025:2017, die de competentie van beproevingslaboratoria regelt, eist dat het laboratorium verifieert dat het een methode correct kan toepassen voordat het die invoert, door aan te tonen dat het de vereiste prestaties haalt en de registraties te bewaren. Een gevalideerde methode die niemand heeft geverifieerd in het laboratorium dat haar gebruikt, laat een gat dat vaak opduikt bij audits. De accreditatie-eisen worden uitgewerkt in het artikel over ISO/IEC 17025 in levensmiddelenlaboratoria.
Validatie: de prestaties van de methode vaststellen
Validatie bestaat uit het bepalen van de prestatiekenmerken van een methode en het leveren van objectief bewijs dat ze voldoet aan de eisen voor een beoogd gebruik. In de levensmiddelenmicrobiologie betekent dat bijna altijd het vergelijken van een alternatieve methode (bijvoorbeeld een PCR-kit of een chromogeen medium) met een referentiemethode, doorgaans een genormaliseerd protocol voor traditionele kweek zoals ISO 6579-1 voor Salmonella.
De ISO 16140-reeks
Het technisch comité ISO/TC 34/SC 9 verving de oude ISO 16140:2003 door een reeks normen, elk bedoeld voor een ander scenario:
- ISO 16140-1:2016: gemeenschappelijk vocabulaire voor validatie.
- ISO 16140-2:2016: protocol om alternatieve, meestal commerciële methoden te valideren ten opzichte van een referentiemethode. Er is een amendement uit 2024 dat een deel van de berekeningen herzag.
- ISO 16140-3:2021: protocol om in één laboratorium referentiemethoden en reeds gevalideerde alternatieve methoden te verifiëren.
- ISO 16140-4: validatie in één enkel laboratorium. De resultaten zijn alleen geldig voor het laboratorium dat de studie uitvoerde.
- ISO 16140-5: factoriële interlaboratoriumvalidatie voor niet-commerciële methoden, met minder deelnemende laboratoria dan in deel 2.
- ISO 16140-6:2019: validatie van alternatieve bevestigings- en typeringsmethoden, die uitgaan van een verdachte kolonie en niet van een levensmiddelenmonster.
De reeks wordt aangevuld met ISO 17468, die de technische eisen vastlegt voor het opstellen of herzien van een genormaliseerde referentiemethode.
Wat een validatie volgens ISO 16140-2 omvat
Het protocol kent twee fasen. De eerste is een vergelijkende studie die in een organiserend laboratorium wordt uitgevoerd: besmette monsters worden met beide methoden geanalyseerd om de gevoeligheid te meten, het relatieve detectieniveau (RLOD) wordt bepaald en de inclusiviteit en exclusiviteit worden getoetst met 50 stammen van het doelmicro-organisme en 30 niet-doelstammen. Bij kwantitatieve methoden beoordeelt de vergelijkende studie de relatieve juistheid en het nauwkeurigheidsprofiel. De tweede fase is een interlaboratoriumstudie, waarin meerdere laboratoria dezelfde monsters analyseren om de reproduceerbaarheid van de methode te schatten.
De reikwijdte van de validatie hangt af van de onderzochte levensmiddelencategorieën. Om een methode geldig te verklaren voor een "breed scala aan levensmiddelen" moeten minstens vijf categorieën worden gedekt. Die reikwijdteverklaring is het eerste wat je op een certificaat moet nagaan.
Wie certificeert
In Europa geven onafhankelijke instanties zoals MicroVal, NF Validation (AFNOR) en NordVal (NMKL) certificaten af op basis van ISO 16140-2 en publiceren ze de rapporten op hun websites. In de Verenigde Staten is het meest verspreide schema dat van AOAC International, dat we uitleggen in de gids over AOAC-PTM-certificering.
Wat de Europese regelgeving zegt
Verordening (EG) 2073/2005 bepaalt in artikel 5 dat de analysemethoden uit bijlage I de referentiemethoden zijn, en dat alternatieve methoden aanvaardbaar zijn wanneer ze zijn gevalideerd ten opzichte van die referentie en, indien commercieel, door een derde zijn gecertificeerd volgens het protocol van EN ISO 16140 of andere internationaal aanvaarde vergelijkbare protocollen. Verordening (EU) 2019/229 voegde sleuteldefinities toe: wat wordt verstaan onder een "breed scala aan levensmiddelen" en wat een certificeringsinstantie is die onafhankelijk is van de fabrikant van de methode.
Verificatie: aantonen dat de methode werkt in jouw laboratorium
ISO 16140-3 definieert verificatie als het aantonen dat een gevalideerde methode in de handen van de gebruiker werkt volgens de specificaties van haar validatie. Het verdeelt het proces in twee fasen.
Fase 1: verificatie van de implementatie
Het laboratorium toont aan dat het de methode kan uitvoeren met één enkel levensmiddel, gekozen uit de levensmiddelen die in de validatiestudie zijn geanalyseerd. Lijken de resultaten op die van de validatie, dan is het onderliggende probleem (de techniek) opgelost.
Fase 2: verificatie van de levensmiddelen van het laboratorium
Vervolgens toont het laboratorium aan dat de methode werkt met de levensmiddelen die het zegt te analyseren. Daarvoor kiest het uit elke categorie binnen zijn scope een "moeilijk" levensmiddel: producten met lage wateractiviteit, met natuurlijke antimicrobiële stoffen zoals specerijen, met lecithine, met veel vet. De opleidingsgids van het ISO-comité zelf toont voorbeelden als ijs, eipoeder, gekruid vlees en cacaopoeder.
Wat wordt gemeten en met welk aanvaardingscriterium
Kwalitatieve methoden: eLOD50
Bij detectiemethoden wordt het detectieniveau bij 50 % geschat (eLOD50): de besmetting waarbij de methode positief is in de helft van de geanalyseerde porties. Het heet "geschat" omdat het aantal monsters veel kleiner is dan bij een volledige validatie. Het aanvaardingscriterium is dat het verkregen eLOD50 niet meer dan vier keer het LOD50 van de validatie bedraagt. In het voorbeeld uit de ISO-opleidingsgids voor Salmonella volgens ISO 6579-1 was de referentie-LOD50 5,7 KVE, lag de grens op 22,8 KVE en behaalde het laboratorium 3,0 KVE, waarmee het voldeed. Het concept LOD50 wordt uitgewerkt in het artikel over detectielimiet en meetonzekerheid.
Kwantitatieve methoden: reproduceerbaarheid en bias
Bij tellingen meet de verificatie van de implementatie de standaardafwijking van de reproduceerbaarheid binnen het laboratorium (SIR), met een opzet in lijn met ISO 19036. Het criterium is dat die niet meer dan het dubbele bedraagt van de laagste gemiddelde reproduceerbaarheidswaarde uit de validatie. De verificatie van de levensmiddelen meet de geschatte bias (eBias): porties worden op drie niveaus in tweevoud besmet, en het verschil met het verwachte niveau mag op geen enkel niveau meer dan 0,5 log10 bedragen.
Bevestigings- en typeringsmethoden
Hier wordt alleen verificatie van de implementatie geëist: doel- en niet-doelstammen worden getest (in het voorbeeld uit de gids vijf van elk type) en 100 % overeenstemming met het verwachte resultaat wordt geëist.
De termijn van 2028 voor niet-gevalideerde referentiemethoden
Veel ISO-referentienormen zijn gepubliceerd zonder prestatiegegevens. Voor die normen biedt ISO 16140-3 in bijlage F een overgangsprotocol. Volgens het overgangsdocument van het ISO-comité kan die bijlage worden gebruikt tot 31 december 2027; vanaf 1 januari 2028 mogen alleen gevalideerde referentiemethoden nog worden geverifieerd conform ISO 16140-3. ISO-normen zijn vrijwillig, maar accreditatie-instanties nemen ze doorgaans als criterium.
Hetzelfde document verduidelijkt wanneer opnieuw moet worden geverifieerd. Een reeds geaccrediteerde methode heeft geen nieuwe verificatie nodig tenzij ze verandert. Een nieuwe methode of een nieuwe levensmiddelencategorie binnen de scope wel. Als een gevalideerde methode een grote technische wijziging met relevante impact ondergaat, ook.
Als de verificatie niet voldoet
De norm vraagt een grondoorzaakanalyse vóór herhaling. Gebruikelijke oorzaken zijn de bereiding en het niveau van het inoculum, de homogenisatie van het monster, de kalibratie van apparatuur, partijen media of reagentia en de toepassing van het protocol door de analist. Blijft het probleem bestaan, dan is de volgende stap de leverancier van de methode te raadplegen (indien commercieel), het normalisatie-instituut (indien referentie) of de certificeringsinstantie.
Veelgemaakte fouten
- Aannemen dat een validatiecertificaat de verificatie in het laboratorium vervangt.
- De methode toepassen op levensmiddelen van een categorie die niet in de scope van haar validatie valt.
- Alleen verifiëren met een "gemakkelijk" levensmiddel en niet met een dat representatief is voor de echte moeilijkheden van het laboratorium.
- De verificatieregistraties niet bewaren, terwijl ze onder ISO/IEC 17025 opeisbaar zijn.
- Een stap van het protocol wijzigen, zoals de duur van de verrijking, en de methode toch als gevalideerd blijven behandelen.
Conclusie
Valideren en verifiëren beantwoorden verschillende vragen: of een methode werkt en of ze werkt in jouw laboratorium. De ISO 16140-reeks ordent beide processen, van de validatie van alternatieve methoden volgens ISO 16140-2 tot de verificatie in één enkel laboratorium volgens ISO 16140-3, met concrete aanvaardingscriteria zoals het eLOD50 of de eBias. De scope van het certificaat nagaan, verifiëren met representatieve levensmiddelen en de registraties bewaren voorkomt dat een goed gevalideerde methode een zwak punt van het laboratorium wordt.
Over TAAG
Ontdek hoe TAAG de gevalideerde scope van zijn moleculaire detectiekits documenteert om de verificatie in het laboratorium van elke klant te vergemakkelijken.
Veelgestelde vragen
Wat is het verschil tussen het valideren en het verifiëren van een microbiologische methode?
Validatie stelt de prestaties van de methode vast en toont aan dat ze geschikt is voor een beoogd gebruik, normaal gesproken door haar met een referentiemethode te vergelijken. Verificatie toont aan dat een concreet laboratorium die prestaties behaalt bij toepassing met zijn eigen apparatuur, personeel en levensmiddelen.
Moet een methode met een MicroVal-, NF Validation- of AOAC-certificaat worden geverifieerd?
Ja. Het certificaat onderbouwt de methode, maar ISO/IEC 17025 eist dat elk laboratorium verifieert dat het haar correct kan toepassen voordat het haar gebruikt, en ISO 16140-3 beschrijft hoe.
Wat is het eLOD50?
Het is het detectieniveau bij 50 %, geschat tijdens de verificatie van een kwalitatieve methode: de besmetting waarbij de methode het micro-organisme aantoont in de helft van de geanalyseerde porties. ISO 16140-3 aanvaardt het resultaat als het niet meer dan vier keer het LOD50 uit de validatie bedraagt.
Wat gebeurt er met ISO-referentiemethoden zonder validatiegegevens?
Tot 31 december 2027 kunnen ze worden geverifieerd met het overgangsprotocol van bijlage F van ISO 16140-3. Vanaf 1 januari 2028 mogen alleen gevalideerde referentiemethoden volgens die norm worden geverifieerd.