Onderdeel van de pijler Grondslagen en standaardisatie van het TAAG Leercentrum. Het werkt een punt uit dat we noemden bij ISO/IEC 17025-accreditatie en bouwt voort op de traditionele microbiologische kweek.
Inhoudsopgave
Ook de voedingsbodem wordt getoetst
Wanneer een laboratorium "Salmonella: niet aangetoond" of een telling van Enterobacteriaceae rapporteert, gaat het ervan uit dat de voedingsbodem waarop is geënt naar behoren werkte. Als een partij selectieve agar ook het gezochte micro-organisme remt, of juist de begeleidende flora laat groeien die onderdrukt moest worden, is het resultaat fout, ook al heeft de analist alles goed gedaan. Daarom heeft de levensmiddelenmicrobiologie een norm die uitsluitend over voedingsbodems gaat: ISO 11133.
De inleiding vat het doel samen in drie ideeën: aantonen dat elke partij voedingsbodem aanvaardbaar is, dat de bodem geschikt is voor het beoogde gebruik en dat hij consistente resultaten geeft. Volgens de norm zelf zijn dit een essentieel onderdeel van de interne kwaliteitscontrole van het laboratorium.
Wat ISO 11133 is en op wie ze van toepassing is
De geldende editie, ISO 11133:2014, verving de technische specificaties ISO/TS 11133-1:2009 en ISO/TS 11133-2:2003 en nam ook de media voor wateranalyse op. De norm definieert de termen voor kwaliteitsborging van media, stelt eisen aan de bereiding ervan en beschrijft methoden en criteria om de prestaties te beoordelen. Ze dekt de media die worden gebruikt voor het onderzoek van levensmiddelen, diervoeders, monsters uit de productieomgeving en water voor consumptie of voor gebruik bij de bereiding van levensmiddelen.
Ze geldt voor wie gedehydrateerde of gebruiksklare media vervaardigt of distribueert, voor niet-commerciële organisaties die ze aan derden leveren en voor laboratoria die hun eigen media bereiden. Amendement 1 uit 2018 voegde uitdrukkelijk de eindgebruikers van gebruiksklare media toe: het kopen van kant-en-klare platen ontslaat het laboratorium niet van de plicht ze te controleren.
Twee amendementen en een nieuwe editie op komst
- Amendement 1 (2018): correcties en verduidelijkingen, onder meer de inoculumniveaus voor de prestatietests.
- Amendement 2 (2020): voegde bijlage K toe, met de controlestammen voor bevestigings- en karakteriseringsmedia en -reagentia.
- Tweede editie: het ontwerp ISO/FDIS 11133, dat de titel "voedingsbodems en reagentia" krijgt, bevindt zich in de laatste stemronde bij ISO en vervangt de editie van 2014 zodra het wordt gepubliceerd.
Het comité ISO/TC 34/SC 9 verduidelijkt bovendien dat normen per micro-organisme die na 2014 zijn gepubliceerd en een eigen paragraaf over prestatietests bevatten, voorrang hebben op wat ISO 11133:2014 voor die media aangeeft.
De drie eigenschappen die worden beoordeeld
Productiviteit
Het is de mate waarin het doelorganisme onder gedefinieerde omstandigheden in de voedingsbodem wordt teruggevonden. Het beantwoordt de meest elementaire vraag: als het micro-organisme aanwezig is, laat de bodem het dan groeien?
Selectiviteit
Het is de mate van remming van een niet-doelorganisme in een selectieve bodem. Een agar voor Salmonella die Escherichia coli ongehinderd laat groeien, levert overwoekerde platen op waarop de typische kolonies verloren gaan.
Specificiteit (elektiviteit)
Het is het bewijs dat niet-doelorganismen, als ze toch groeien, niet dezelfde visuele kenmerken vertonen als het doelorganisme: de kleur, de halo of de morfologie waaraan de analist een verdachte kolonie herkent. Bij chromogene media is dit de eigenschap die voorkomt dat de ene kolonie voor de andere wordt aangezien.
Hoe ze worden getest
Kwantitatieve test en productiviteitsratio
Voor vaste telmedia vergelijkt de norm de groei op het te testen medium met die op een referentiemedium, doorgaans een niet-selectief medium zoals tryptone-sojaagar (TSA). Het resultaat is de productiviteitsratio, PR = NS/N0: de telling op het te testen medium gedeeld door de telling op het referentiemedium. Amendement 1 stelt het inoculum vast op ongeveer 100 KVE om voldoende nauwkeurigheid te krijgen, met een praktisch bereik van 80 tot 120 KVE per plaat en een minimum van 50.
Het gebruikelijke criterium is een PR van ten minste 0,5 voor selectieve media en ten minste 0,7 voor niet-selectieve media. Een concreet voorbeeld uit de norm: TBX-agar voor β-glucuronidasepositieve E. coli wordt getest met E. coli-stammen, vergeleken met TSA en moet een PR ≥ 0,5 geven met blauwe kolonies.
Kwalitatieve tests
Bij vloeibare media en sommige vaste media wordt het resultaat uitgedrukt op een eenvoudige schaal: 0 (geen groei of geen troebeling), 1 (zwakke groei) en 2 (goede groei). Voor de selectiviteit eist amendement 1 dat ten minste 104 KVE van het niet-doelorganisme worden geïnoculeerd; voor de specificiteit op platen ten minste 103 KVE.
Selectieve ophopingsbouillons
Bouillons zoals RVS voor Salmonella worden getest door het doelorganisme, het niet-doelorganisme of een mengsel van beide te inoculeren en vervolgens uit te strijken op een isolatiemedium (bijvoorbeeld XLD) en op een niet-selectief medium. De selectiviteit van de bouillon wordt als bevredigend beschouwd als er op de niet-selectieve plaat geen groei van het niet-doelorganisme is, of minder dan 10 of minder dan 100 KVE, al naargelang de betreffende bijlage of de specifieke norm aangeeft. Het is hetzelfde principe dat het succes van de microbiologische ophoping in een echt monster bepaalt.
Multifunctionele en bevestigingsmedia
Voor een medium met meerdere toepassingen, zoals gebufferd peptonwater (BPW), vraagt amendement 1 minstens één preënrichtingstest met een voor het laboratorium relevante pathogeen, bijvoorbeeld Salmonella. Bij bevestigingsmedia en -reagentia (bijlage K) is de test kwalitatief omdat wordt uitgegaan van een geïsoleerde kolonie: de positieve controle wordt de minimale door de norm toegestane tijd geïncubeerd en de negatieve de maximale. Zo wordt gecontroleerd dat de positieve op tijd verschijnt en dat de negatieve niet omslaat door te lange incubatie. De bevestiging van verdachte kolonies wordt toegelicht in het artikel over presumptief en bevestigd resultaat.
Controlestammen: waarom het WDCM-nummer ertoe doet
Een prestatietest is alleen tussen laboratoria vergelijkbaar als iedereen gelijkwaardige stammen gebruikt. ISO 11133 definieert een nauwkeurige keten:
- Referentiestam: rechtstreeks verkregen van een collectie die lid is van de World Federation for Culture Collections (WFCC) of van de Europese organisatie ECCO, geïdentificeerd tot minstens op geslachts- en soortniveau.
- Referentiestock: identieke culturen verkregen door één enkele subcultuur van de referentiestam.
- Stockcultuur: primaire subcultuur van de referentiestock.
- Werkcultuur: de cultuur die in de test wordt gebruikt, verkregen uit de referentiestock, de stockcultuur of een referentiemateriaal.
Elke collectie nummert haar stammen op haar eigen manier, zodat dezelfde stam in elke catalogus een andere code heeft. Het World Data Centre for Microorganisms (WDCM) loste dat probleem op met een unieke identificatie: de WDCM-catalogus van referentiestammen. WDCM 00031 komt bijvoorbeeld overeen met Salmonella Typhimurium NCTC 12023 in de Britse collectie.
Een voorbeeld uit de officiële lijst
Het comité ISO/TC 34/SC 9 publiceert een lijst met controlestammen voor elk medium en reagens uit zijn normen; de vierde editie dateert van mei 2025. Voor XLD-agar uit ISO 6579-1 vermeldt de lijst Salmonella Enteritidis WDCM 00030 of Typhimurium WDCM 00031, E. coli WDCM 00012 of 00013 en Enterococcus faecalis WDCM 00009 of 00087. Een opmerking waarschuwt dat sommige nationale voorschriften een andere serovar van Salmonella kunnen eisen, en een andere markering met de letter "b" geeft de stammen aan die minimaal moeten worden gebruikt.
Verder dan de microbiologische test
De controle van een medium begint vóór het enten. ISO 11133 eist dat de fabrikant onder meer de naam en de componenten van het medium, het technisch gegevensblad, het partijnummer, de beoogde pH van het complete medium, de opslagomstandigheden en de vervaldatum documenteert. Een laboratorium dat eigen media bereidt, moet bovendien zorgen voor het water, het wegen, de sterilisatie, de uiteindelijke pH en de opslag; ISO 7218:2024 vult die algemene eisen voor het microbiologisch laboratorium aan.
Dit alles sluit aan bij ISO/IEC 17025, die verplicht de geschiktheid van extern geleverde producten te waarborgen en de geldigheid van de resultaten te bewaken. Een partij die de controle niet doorstaat, is niet-conform werk: er moet worden beoordeeld welke analyses mogelijk zijn beïnvloed, zoals besproken in het artikel over ISO/IEC 17025-accreditatie. Bij moleculaire methoden geldt dezelfde logica, met eigen controles, die worden toegelicht in het artikel over de controles van een PCR.
Veelgemaakte fouten
- Het certificaat van de leverancier als enige controle aanvaarden, zonder de partij in het laboratorium te verifiëren.
- Gesubkweekte collectiestammen gebruiken zonder registratie, zodat de herkomst niet tot de referentiestam kan worden herleid.
- De productiviteit testen met zeer hoge inocula, die een gedeeltelijke remming van het medium verbergen.
- De productiviteit controleren en de selectiviteit of specificiteit vergeten bij selectieve en chromogene media.
- Er geen rekening mee houden dat de specifieke norm van het micro-organisme eigen stammen en criteria kan vaststellen die voorrang hebben op ISO 11133.
Conclusie
Een voedingsbodem is een reagens met meetbare prestaties, geen neutrale grondstof. ISO 11133 regelt hoe dat wordt aangetoond: productiviteit ten opzichte van een referentiemedium, selectiviteit met hoge inocula van niet-doelorganismen, specificiteit bij differentiële media en traceerbare controlestammen via WDCM-nummers. Elke partij controleren, de keten van subculturen registreren en nagaan wat de norm van elk micro-organisme eist, voorkomt dat een resultaat afhangt van een defecte partij zonder dat iemand het weet.
Over TAAG
Ontdek hoe TAAG het werk van het kweeklaboratorium aanvult met moleculaire detectiekits die hun eigen reactiecontroles bevatten.
Veelgestelde vragen
Wat is ISO 11133?
Het is de internationale norm die bepaalt hoe voedingsbodems die worden gebruikt in de microbiologie van levensmiddelen, diervoeders, productieomgeving en water worden bereid, geproduceerd, opgeslagen en op hun prestaties gecontroleerd. De geldende editie dateert van 2014, met amendementen uit 2018 en 2020.
Wat is het verschil tussen productiviteit, selectiviteit en specificiteit van een medium?
De productiviteit meet hoeveel van het doelorganisme het medium terugwint. De selectiviteit meet in hoeverre niet-doelorganismen worden geremd. De specificiteit toont aan dat niet-doelorganismen die toch groeien visueel niet met het doelorganisme worden verward.
Wat is een WDCM-nummer?
Het is een unieke identificatie die het World Data Centre for Microorganisms toekent aan stammen die worden aanbevolen voor kwaliteitscontrole. Daaraan is te zien dat stammen met verschillende codes in verschillende collecties in werkelijkheid dezelfde zijn.
Moet een laboratorium dat gebruiksklare platen koopt, deze controleren?
Ja. Amendement 1 uit 2018 nam de eindgebruikers van gebruiksklare media uitdrukkelijk op in het toepassingsgebied van ISO 11133, en ISO/IEC 17025 eist dat de geschiktheid van extern geleverde benodigdheden wordt geverifieerd.