Onderdeel van de pijler fundamenten en standaardisatie van het TAAG Leercentrum. Verdiept wat we zagen over hoe je KVE interpreteert en over de fase van microbiologische verrijking.
Inhoudsopgave
Een microbiologisch resultaat heeft altijd een marge
Een rapport zegt "Salmonella: niet aangetoond in 25 g" of "aerobe mesofiele kiemen: 1,2 × 105 KVE/g". Beide resultaten lijken definitief, maar geen van beide is dat helemaal. Het eerste hangt af van de kans dat de methode de weinige cellen detecteert die in de geanalyseerde portie kunnen zitten. Het tweede is een schatting met een spreiding die in de microbiologie veel groter is dan bij een chemische analyse. Die marges begrijpen maakt het mogelijk goed te beslissen wanneer een resultaat dicht bij een limiet ligt.
Waarom de microbiologie anders is
Bacteriën verdelen zich niet in een levensmiddel zoals een opgeloste stof. Het zijn discrete deeltjes, vaak in groepjes, en bij lage concentratie is hun aanwezigheid in een testportie een kwestie van toeval. Als een partij gemiddeld één cel Salmonella per 25 g bevat, zullen sommige porties van 25 g er geen hebben, andere één en andere twee of meer. Die toevallige verdeling volgt een Poisson-verdeling en legt een theoretische grens vast die geen enkele methode kan overschrijden.
Het theoretische plafond van elke methode
Bij een Poisson-verdeling is de kans dat een portie minstens één cel bevat 1 − e−λ, waarbij λ het gemiddeld aantal cellen per portie is. Bij een gemiddelde van 1 KVE per portie is die kans ongeveer 63 %: zelfs een perfecte methode zou in meer dan een derde van de gevallen falen, simpelweg omdat de cel niet in de portie zit. Voor 50 % detectie volstaat een gemiddelde van ln 2, ongeveer 0,69 KVE per portie; voor 95 % zijn ongeveer 3 KVE per portie nodig.
Kwalitatieve methoden: van LOD naar LOD50
Bij een detectiemethode (aan- of afwezigheid) wordt de detectielimiet niet uitgedrukt als een vast getal, maar als een curve van detectiekans (POD) in functie van de besmetting. Wilrich en Wilrich beschreven in 2009 in het Journal of AOAC International een statistisch model om die curve en de LODp te schatten, de besmetting die de methode met een kans p detecteert. De meest gebruikte waarde is de LOD50: de concentratie waarbij de methode positief is in de helft van de geanalyseerde porties.
De LOD50 maakt het mogelijk methoden onderling en met het theoretische plafond te vergelijken. ISO 16140-2 gebruikt haar om het relatieve detectieniveau (RLOD) tussen een alternatieve methode en de referentiemethode te berekenen, en ISO 16140-3 vraagt elk laboratorium zijn eigen eLOD50 te schatten bij het verifiëren van een methode en na te gaan dat die niet meer dan vier keer die van de validatie bedraagt. De procedure wordt uitgelegd in het artikel over validatie en verificatie van methoden.
Wat "afwezig in 25 g" betekent
Een negatief resultaat betekent dat de methode het micro-organisme in die portie niet heeft aangetoond, niet dat de partij ervan vrij is. Daarom worden afwezigheidscriteria toegepast op meerdere monstereenheden, en daarom is de fase van verrijking zo belangrijk: zij laat toe dat één enkele cel, vaak beschadigd, zich vermenigvuldigt tot detecteerbare niveaus. Hoeveel eenheden je moet analyseren en welke kans elk plan biedt om een besmette partij op te sporen, wordt uitgewerkt in het artikel over bemonsteringsplannen op basis van attributen.
Kwantitatieve methoden: de kwantificatielimiet
Bij een plaattelling wordt de ondergrens bepaald door de laagste uitgeplaatste verdunning. Wordt 1 mL van de verdunning 10−1 uitgeplaat en groeit er geen enkele kolonie, dan is het resultaat niet "0 KVE/g", maar "minder dan 10 KVE/g" (in het voorbeeld uit de ISO 19036-gids, met twee verdunningen zonder kolonies, is de berekende limiet 9,1 KVE/g). "0" rapporteren is een van de interpretatiefouten die we al bespraken in het artikel over KVE.
Meetonzekerheid bij tellingen: ISO 19036:2019
ISO/IEC 17025 eist van geaccrediteerde laboratoria dat ze de meetonzekerheid van hun beproevingen beoordelen. Voor tellingen in de levensmiddelenmicrobiologie is de referentie ISO 19036:2019, gepubliceerd in oktober 2019 als herziening van de technische specificatie uit 2006. De presentatie van de ISO-werkgroep herinnert eraan dat kwantitatieve resultaten in de microbiologie zeer variabel zijn, in de orde van 0,1 tot 1 log10.
De drie componenten
- Technische onzekerheid: de variabiliteit van de analysestappen (wegen, verdunnen, uitplaten, incuberen, tellen, bevestigen, partijen media, analisten). Ze wordt bij voorkeur geschat als de standaardafwijking van de reproduceerbaarheid binnen het laboratorium (sIR), door minstens 10 monsters met elk twee resultaten te analyseren onder omstandigheden die even sterk variëren als in de routine. Het is meestal de grootste component.
- Matrixonzekerheid: in hoeverre de testportie het laboratoriummonster niet vertegenwoordigt. Voor vloeistoffen of goed gehomogeniseerde monsters kan een vaste waarde van 0,1 log10 worden gebruikt; bij vaste of samengestelde levensmiddelen kan ze veel groter zijn.
- Verdelingsonzekerheid: de willekeurige Poisson-variatie. Ze wordt berekend uit het totaal geteld aantal kolonies (0,4343/√ΣC in log10) en weegt vooral door wanneer weinig kolonies worden geteld.
Uitgebreide onzekerheid en hoe ze wordt gerapporteerd
De componenten worden gecombineerd als de vierkantswortel van de som van hun kwadraten, en het resultaat wordt vermenigvuldigd met een dekkingsfactor k = 2, wat ongeveer overeenkomt met een betrouwbaarheidsniveau van 95 %. De norm laat ook een vereenvoudigde optie toe, alleen de reproduceerbaarheid gebruiken, met de waarschuwing dat dit de onzekerheid kan onderschatten bij vaste levensmiddelen of lage niveaus.
Het voorbeeld uit de ISO-gids toont het goed: een telling van 1,00 × 105 KVE/g, met een uitgebreide onzekerheid van 0,31 log10, wordt gerapporteerd als 5,00 ± 0,31 log10 KVE/g. In natuurlijke waarden loopt het interval van 4,90 × 104 tot 2,04 × 105 KVE/g: meer dan het dubbele tussen het ene uiteinde en het andere.
Wat de meetonzekerheid niet omvat
ISO 19036 laat twee foutbronnen buiten beschouwing. De eerste is de bemonsteringsonzekerheid, de fout bij het nemen van het laboratoriummonster uit de partij, die groot kan zijn maar niet aan het laboratorium wordt toegeschreven. De tweede is de bias: in de levensmiddelenmicrobiologie bestaat geen "ware" waarde, onafhankelijk van de methode, waarmee een routineresultaat kan worden vergeleken.
Van getal naar beslissing
Stel je een telling voor van 1,2 × 102 KVE/g tegenover een limiet van 100 KVE/g. Met een typische uitgebreide onzekerheid van enkele tienden van een log kan de werkelijke waarde onder de limiet liggen. Voldoet het product of niet? Het antwoord hangt af van de beslisregel. ISO/IEC 17025 vraagt dat het laboratorium, wanneer het conformiteit verklaart, de regel die het gebruikt en het risico op onterechte aanvaarding of afwijzing documenteert. Een gebruikelijk criterium beschouwt een resultaat pas als niet-conform als het de limiet met meer dan de uitgebreide onzekerheid overschrijdt; een ander, behoudender criterium beschouwt alleen wat onder de limiet min die onzekerheid ligt als conform. Kiezen tussen beide is een beslissing van risicobeheer, geen detail van het laboratorium.
Veelgemaakte fouten
- "Niet aangetoond" lezen als garantie van afwezigheid in de hele partij.
- Methoden alleen vergelijken op hun responstijd, zonder hun LOD50 in de relevante matrix na te gaan.
- "0 KVE/g" rapporteren in plaats van "< kwantificatielimiet".
- Verschillen van 0,2 of 0,3 log tussen twee tellingen behandelen als een echte procesverandering.
- De conformiteitsverklaring vragen zonder vooraf de beslisregel overeen te komen.
Conclusie
In de microbiologie komt een resultaat nooit alleen: het brengt een detectiekans mee als het kwalitatief is en een onzekerheid als het kwantitatief is. De LOD50 maakt het mogelijk methoden te vergelijken en te begrijpen wat een negatief resultaat werkelijk betekent; ISO 19036 maakt het mogelijk elke telling van een interval te voorzien. Die marges gebruiken, samen met een overeengekomen beslisregel, voorkomt dat een partij wordt vrijgegeven of afgewezen om een verschil dat de methode zelf niet kan onderscheiden.
Over TAAG
Ontdek de prestatiegegevens van de moleculaire detectiekits van TAAG, gebaseerd op de RT-qPCR-technologie AiGOR™, en hoe ze in elke validatie worden gedocumenteerd.
Veelgestelde vragen
Wat is de LOD50 van een microbiologische methode?
Het is de concentratie van het micro-organisme waarbij een detectiemethode positief is in 50 % van de geanalyseerde porties. Ze wordt gebruikt omdat detectie in de microbiologie probabilistisch is: zelfs een perfecte methode haalt 50 % detectie pas bij ongeveer 0,69 KVE gemiddeld per portie, door de toevallige verdeling van de cellen.
Waarom betekent een resultaat "niet aangetoond" niet nul?
Omdat de methode maar een portie van het monster analyseert en een detectielimiet heeft. Als het micro-organisme in lage concentratie of onregelmatig verdeeld voorkomt, kan het niet in de geanalyseerde portie zitten of geen detecteerbare niveaus bereiken.
Welke norm wordt gebruikt om de onzekerheid van een microbiologische telling te schatten?
ISO 19036:2019. Ze combineert de technische, de matrix- en de verdelingsonzekerheid en drukt het resultaat uit als uitgebreide onzekerheid met een dekkingsfactor k = 2, ongeveer 95 % betrouwbaarheid.
Omvat de meetonzekerheid de bemonsteringsfout van de partij?
Nee. ISO 19036 sluit de bemonsteringsonzekerheid uitdrukkelijk uit, dat wil zeggen de fout bij het nemen van het monster uit de partij. Dat risico wordt beheerst met de opzet van het bemonsteringsplan.