Onderdeel van de pijler laboratoriummethoden van het TAAG Leercentrum, naast microbiologische verrijking.
Inhoudsopgave
Een positief resultaat is niet altijd een eindresultaat
In een laboratoriumrapport kan "positief" twee verschillende dingen betekenen. Het kan een presumptief resultaat zijn: de test gaf een signaal dat past bij het gezochte micro-organisme, maar de identiteit is nog niet aangetoond. Of het kan een bevestigd resultaat zijn: het micro-organisme is geïsoleerd en met aanvullende tests is aangetoond dat het werkelijk het doel van de analyse is. Beide verwarren leidt tot overhaaste beslissingen in de ene of de andere richting: product vrijgeven dat moest worden tegengehouden of een partij vernietigen om een resultaat dat niet standhield.
Dit artikel loopt dat deel van de analyse door, van screening tot bevestiging, met als referentie het Bacteriological Analytical Manual (BAM) van de FDA voor Salmonella en de ISO 16140-reeks, die bepaalt hoe alternatieve methoden ten opzichte van referentiemethoden worden gevalideerd.
Waar een presumptief resultaat vandaan komt
Bij traditionele kweek
Bij traditionele microbiologische kweek is een kolonie met de typische morfologie op een selectief medium een presumptieve bevinding. Hoofdstuk 5 van het BAM beschrijft de volgorde voor Salmonella: voorbereiding en pre-verrijking op de eerste dag, selectieve verrijking op de tweede, uitplaten op selectieve platen op de derde, biochemische screening op de vierde en bevestiging op de vijfde. Het handboek zelf geeft aan dat de kweekmethode 4 tot 5 dagen duurt om tot een presumptief resultaat te komen.
Bij moleculaire screeningsmethoden
PCR en andere snelle methoden worden vaak als screening gebruikt. De BAM-editie van januari 2026 bevat een sectie, toegevoegd in mei 2024, met door de FDA ontwikkelde qPCR- en LAMP-methoden die worden toegepast op de pre-verrijkingskweek van 24 uur, dus op de tweede dag. De regel die het handboek vastlegt is duidelijk: monsters met een negatieve screening worden als negatief gerapporteerd en vragen geen verdere kweekanalyse; monsters met een positieve screening moeten door kweek worden bevestigd volgens de isolatie- en identificatieprocedures.
Die asymmetrie verklaart de waarde van de screening. De meeste routinemonsters zijn negatief, en voor hen komt het resultaat dagen eerder. Alleen de positieve doorlopen de lange weg.
Wat ISO 16140-2 zegt over bevestiging
ISO 16140-2:2016 is het protocol voor de validatie van alternatieve (doorgaans commerciële) methoden ten opzichte van een referentiemethode. De norm vertrekt van een idee dat in het dagelijks werk nuttig is: veel alternatieve methoden hebben twee stappen, eerst de verrijking en detectie, en daarna de bevestiging van dat resultaat. Het eindresultaat van de methode is dat wat uit de tweede stap komt.
Tijdens de validatie eist de norm dat de positieve resultaten van de alternatieve methode die niet overeenkomen met de referentiemethode worden bevestigd, omdat die bevestiging toelaat te weten of het een echt of een vals positief resultaat is. De bevestiging moet het isolaat kunnen terugwinnen en zijn identiteit kunnen aantonen, en kan gebaseerd zijn op de procedure van de referentiemethode, op de bevestigingsstap van de alternatieve methode zelf, op een combinatie van beide of op een ander middel waarmee het micro-organisme kan worden geïsoleerd en geïdentificeerd.
Er is een technisch detail met praktische gevolgen. Als de verrijking van de alternatieve methode verschilt van die van de referentie (minder stappen of minder incubatieuren), vraagt de norm een tweede bevestigingsroute: een deel van de verrijking van de alternatieve methode overbrengen naar het schema van de referentiemethode, met minstens respect voor haar totale incubatietijd. Met andere woorden, een korte verrijking kan volstaan om een moleculair signaal te detecteren, maar niet noodzakelijk om een kolonie op een plaat terug te winnen.
Deze norm heeft regelgevend gewicht. In de Europese Unie wijzigde Verordening (EU) 2019/229 artikel 5 van Verordening (EG) 2073/2005 om te eisen dat alternatieve methoden zijn gevalideerd ten opzichte van de referentiemethode van bijlage I conform EN ISO 16140-2, en dat geregistreerde methoden zijn gecertificeerd door een onafhankelijke instantie. In de praktijk omvatten de validatie en de AOAC-PTM- of ISO 16140-certificering van een methode haar bevestigingsprotocol.
Hoe er tegenwoordig wordt bevestigd
Biochemie en serologie
De klassieke route combineert biochemische tests, die nagaan welke substraten het isolaat metaboliseert, met serologie, die oppervlakte-antigenen identificeert. Voor Salmonella vraagt het BAM dat de serologische bevestiging, met de somatische (O) en flagellaire (H) antigenen, altijd gepaard gaat met biochemische bevestiging. Het staat toe de conventionele reeks buizen te vervangen door systemen als API 20E, Enterotube II of Vitek 2 GN, maar waarschuwt dat commerciële biochemische kits serologie niet vervangen.
Instrumentele en moleculaire methoden op het isolaat
Het BAM aanvaardt ook als bevestiging van presumptieve isolaten een door de FDA ontwikkelde qPCR en LAMP, een isotherme amplificatiemethode (AOAC OMA 2013.14) en identificatie met MALDI-TOF-massaspectrometrie (AOAC OMA 2017.09), naast andere methoden gevalideerd volgens de richtlijnen van de FDA, Appendix J van AOAC of ISO 16140-6:2019. Een isolaat wordt als Salmonella gerapporteerd als serologie en biochemie samen het bevestigen, of een van de aanvaarde instrumentele methoden. Als de bevestigingen elkaar tegenspreken, wordt teruggegrepen op aanvullende tests of een referentielaboratorium voor de definitieve typering.
ISO 16140-6: de bevestigingsmethode zelf valideren
ISO 16140-6:2019 dekt de validatie van alternatieve bevestigings- en typeringsmethoden. Ze vergelijkt de alternatieve methode met de bevestigingsprocedure van de referentiemethode of, waar nodig, met een referentiebevestigingsmethode zoals whole genome sequencing (WGS). Ze geldt ook voor typering, bijvoorbeeld serotypering van Salmonella of moleculaire typering van STEC.
Waarom een presumptief resultaat misschien niet wordt bevestigd
Een positieve screening die niet wordt bevestigd, betekent niet automatisch dat de test "zich vergiste". De mogelijke oorzaken zijn verschillend en het is goed ze te onderscheiden:
- Genetisch materiaal zonder levensvatbare cel: een DNA-gebaseerde methode kan resten detecteren van cellen die zijn geïnactiveerd door een hittebehandeling of een ontsmettingsmiddel, een grens die we uitlegden in RNA versus DNA. In dat geval is er niets levends te isoleren.
- Kruisreactiviteit: een niet-doelorganisme dat een deel van de gezochte sequentie deelt. Dat is wat de exclusiviteitsstudie tijdens de validatie van de methode beoordeelt.
- Moeilijkheid om het isolaat terug te winnen: gestreste cellen, een begeleidende microbiota die in de verrijking concurreert of zeer lage niveaus kunnen verhinderen dat de kolonie wordt verkregen, ook al was het pathogeen aanwezig. Daarom voorziet ISO 16140-2 in de tweede bevestigingsroute wanneer de verrijkingen verschillen.
- Contaminatie in het laboratorium: verslepen van geamplificeerd materiaal of van een positieve controle. De controles van elke run, die we uitwerken in controles van een PCR, bestaan om dat op te sporen.
Wat je doet terwijl de bevestiging komt
De bevestiging is een analytische stap, maar de beslissing over het product neemt de fabriek. Enkele redelijke criteria:
- Eindproduct: een partij met een presumptief positief resultaat wordt vastgehouden tot de bevestiging. Een partij vrijgeven "omdat het nog niet bevestigd is" keert de logica van de screening om.
- Omgeving: in een omgevingsmonitoringprogramma behandelen veel fabrieken het presumptieve resultaat als een signaal om onmiddellijk te handelen (versterkte reiniging, bemonstering van vectoren rond het positieve punt) zonder op de bevestiging te wachten, omdat de kosten van te laat reageren groter zijn.
- Traceerbaarheid van het isolaat: als het resultaat wordt bevestigd, maakt het bewaren van het isolaat het mogelijk het later te typeren en te vergelijken met eerdere bevindingen in dezelfde fabriek.
Wat je niet moet doen is een presumptief resultaat als definitief rapporteren, noch een niet-bevestigd presumptief resultaat verwerpen zonder te begrijpen waarom het niet werd bevestigd. Beide zijn laboratoriumbeslissingen die in de procedure moeten staan voordat het eerste positieve resultaat binnenkomt.
Conclusie
Een presumptief resultaat is een signaal dat de identiteit van het micro-organisme nog niet heeft aangetoond, en een bevestigd resultaat is een isolaat dat met aanvullende tests is geïdentificeerd. Het BAM van de FDA eist dat positieve screeningsresultaten door kweek worden bevestigd, ISO 16140-2 integreert de bevestiging in de validatie van alternatieve methoden en ISO 16140-6 maakt het mogelijk snellere methoden voor die stap te valideren. Tussen beide momenten beslist de fabriek: het product vasthouden, handelen op de omgeving en vastleggen wat er gebeurt wanneer een presumptief resultaat niet wordt bevestigd.
Over TAAG
Praat met TAAG over hoe je moleculaire screening en bevestiging integreert in de procedure van jouw laboratorium volgens het regelgevend kader dat op jouw producten van toepassing is.
Veelgestelde vragen
Is een positieve PCR een definitief resultaat?
In de meeste schema's niet. Het BAM van de FDA bepaalt dat monsters met een positieve screening via qPCR of LAMP door kweek moeten worden bevestigd, terwijl negatieve zonder verdere analyse als negatief worden gerapporteerd.
Hoe lang duurt de bevestiging van Salmonella door kweek?
Het BAM beschrijft een stroom van vijf dagen: pre-verrijking, selectieve verrijking, uitplaten, biochemische screening en bevestiging. Het handboek zelf geeft aan dat de kweekmethode 4 tot 5 dagen duurt om tot een presumptief resultaat te komen.
Kan er worden bevestigd met MALDI-TOF of PCR in plaats van serologie?
Ja, op het isolaat. Het BAM aanvaardt onder meer een qPCR en een LAMP van de FDA en identificatie met MALDI-TOF (AOAC OMA 2017.09). ISO 16140-6:2019 bepaalt hoe deze alternatieve bevestigingsmethoden worden gevalideerd.
Wat betekent het dat een presumptief resultaat niet wordt bevestigd?
Het kan een vals positief resultaat zijn, maar ook DNA van niet-levensvatbare cellen, een moeilijk terug te winnen isolaat of een contaminatie in het laboratorium. Daarom is het verstandig de oorzaak te onderzoeken voordat het resultaat wordt verworpen.