Totale coliformen, E. coli en enterococcen in water: wat elke indicator onthult

Drie indicatoren, drie verschillende vragen

Wanneer een laboratoriumrapport over water totale coliformen, E. coli en enterococcen vermeldt, wordt niet drie keer dezelfde meting herhaald. Elke indicator beantwoordt een andere vraag: of de behandeling en het leidingnet goed functioneren, of er recente fecale besmetting is geweest en of die besmetting pathogenen kan meebrengen die resistenter zijn dan E. coli. In het artikel over microbiologie van water zagen we waarom met indicatoren wordt gewerkt in plaats van elk mogelijk pathogeen afzonderlijk te zoeken; hier ligt de focus op het afzonderlijk lezen van elk resultaat en op weten wat je doet als er een positief uitkomt.

Totale coliformen: de brede groep

Volgens de WHO-richtlijnen voor drinkwaterkwaliteit zijn totale coliformen gramnegatieve, aerobe of facultatief anaerobe, niet-sporenvormende staafjes die groeien in aanwezigheid van galzouten en lactose vergisten met vorming van zuur of aldehyde binnen 24 uur bij 35-37 °C. Bij het vergisten van lactose produceren ze het enzym β-galactosidase, de basis van veel chromogene en enzymatische methoden.

Citrobacter, Klebsiella en Enterobacter

Traditioneel werd aangenomen dat de groep de geslachten Escherichia, Citrobacter, Klebsiella en Enterobacter omvatte, al benadrukt de WHO dat de groep heterogener is en ook andere geslachten zoals Serratia en Hafnia bevat. Veel van deze bacteriën hebben een omgevingsoorsprong: ze leven in bodem en water en kunnen overleven en zich vermenigvuldigen in distributiesystemen, vooral waar biofilms aanwezig zijn. Daarom beschouwt de WHO ze niet als bruikbare indicator voor fecale pathogenen.

Hun waarde ligt ergens anders: ze moeten direct na de desinfectie afwezig zijn, zodat hun aanwezigheid wijst op een ontoereikende behandeling. Duiken ze op in het leidingnet of in een opslagtank, dan wijzen ze op nagroei, biofilmvorming of het binnendringen van vreemd materiaal, zoals grond of plantenresten. Het is een vergelijkbare logica als bij Enterobacteriaceae als hygiëne-indicator op oppervlakken: ze signaleren een falen van het systeem, geen concreet pathogeen.

Thermotolerante ("fecale") coliformen en E. coli

Binnen de totale coliformen worden de bacteriën die lactose bij 44-45 °C vergisten thermotolerant genoemd; in de praktijk spreken veel laboratoria nog van "fecale coliformen". In de meeste wateren is Escherichia het overheersende geslacht, maar sommige typen Citrobacter, Klebsiella en Enterobacter zijn ook thermotolerant, waardoor de groep omgevingsorganismen kan bevatten.

E. coli onderscheidt zich van de andere thermotolerante coliformen door de vorming van indol uit tryptofaan of door het enzym β-glucuronidase. Het komt in zeer grote aantallen voor in de ontlasting van mens en dier, verschijnt zelden zonder fecale besmetting en de omstandigheden in een distributienet laten nauwelijks groei toe. Daarom beschouwt de WHO het als de meest geschikte indicator voor fecale besmetting en accepteert zij thermotolerante coliformen alleen als minder betrouwbaar alternatief. Wil je meer weten over de soort en haar pathogene stammen, lees dan het artikel over E. coli en STEC.

Intestinale enterococcen: de meest resistente indicator

Intestinale enterococcen zijn grampositieve bacteriën die zout en alkalische pH verdragen, en die de WHO indeelt in vier soorten: Enterococcus faecalis, E. faecium, E. durans en E. hirae. In menselijke ontlasting liggen hun aantallen doorgaans ongeveer een orde van grootte onder die van E. coli, en de meeste soorten vermenigvuldigen zich niet in water.

Hun belangrijkste voordeel is persistentie: ze overleven langer in het aquatisch milieu dan E. coli, verdragen uitdroging beter en zijn resistenter tegen chlorering. Daarom worden ze in ruw water gebruikt als indicator voor duurzamere fecale pathogenen, in drinkwater als aanvulling op het onderzoek naar E. coli, en om de waterkwaliteit te verifiëren na reparaties aan het leidingnet of de aanleg van nieuwe leidingen.

Wat een positief resultaat betekent en welke actie volgt

• Totale coliformen positief, E. coli negatief: geen bewijs van fecale besmetting, wel van een falen in de behandeling of de integriteit. Het monster wordt herhaald, de desinfectie wordt gecontroleerd en er wordt gezocht naar toegangspunten of biofilms in het leidingnet.
• E. coli of thermotolerante coliformen positief: bewijs van recente fecale besmetting. De WHO vraagt om onmiddellijk onderzoek: nieuwe bemonstering en zoeken naar de oorzaak, zoals een ontoereikende behandeling of een breuk in het leidingnet.
• Intestinale enterococcen positief: ook een aanwijzing voor recente fecale besmetting, die hetzelfde onderzoek vereist. Verschijnen ze zonder E. coli, houd dan rekening met een oudere besmetting of met gechloreerd water waarin E. coli al is geïnactiveerd.

Wat de normen eisen

De WHO bepaalt dat E. coli (of, bij gebrek daaraan, thermotolerante coliformen) niet aantoonbaar mag zijn in enig monster van 100 ml water dat rechtstreeks voor consumptie bestemd is. Richtlijn (EU) 2020/2184 stelt 0 per 100 ml vast voor E. coli en intestinale enterococcen als verplichte microbiologische parameters (0 per 250 ml in verpakt water), en houdt coliforme bacteriën aan als indicatorparameter, eveneens met 0 per 100 ml, bedoeld om te verifiëren dat de beheersmaatregelen werken. Als referentiemethoden noemt ze EN ISO 9308-1 of 9308-2 voor E. coli en coliformen, en EN ISO 7899-2 voor enterococcen.

In de Verenigde Staten stelt de Revised Total Coliform Rule van de EPA, verplicht sinds 1 april 2016, een maximumwaarde (MCL) vast voor E. coli en gebruikt totale coliformen als aanleiding voor een aanpak van "opsporen en corrigeren". Na een positief resultaat voor totale coliformen worden binnen 24 uur drie herhalingsmonsters genomen; een opeenstapeling van positieve resultaten leidt tot een evaluatie op niveau 1, en een overschrijding van de MCL voor E. coli leidt tot een evaluatie op niveau 2 en een onmiddellijke publieke waarschuwing.

Water in de levensmiddelenfabriek: ingrediënt en proceshulpmiddel

Voor de levensmiddelenindustrie staan deze grenswaarden niet ver af. Richtlijn 2020/2184 neemt in haar definitie uitdrukkelijk het water op dat in levensmiddelenbedrijven wordt gebruikt voor de vervaardiging, verwerking, conservering of verhandeling van producten voor menselijke consumptie. Daarnaast eist Verordening (EG) nr. 852/2004 een toereikende voorziening van drinkwater, dat moet worden gebruikt wanneer dat nodig is om besmetting van levensmiddelen te voorkomen; ijs dat met levensmiddelen in contact komt, moet van drinkwater worden gemaakt (of van schoon water in het geval van hele vis), en hergebruikt water moet aan dezelfde eisen voldoen als drinkwater, tenzij de bevoegde autoriteit anders toestaat.

In de praktijk is het zinvol twee toepassingen te onderscheiden:

• Water als ingrediënt: dranken, pekel, deeg of ijs. Elke positieve fecale indicator raakt direct het product en de traceerbaarheid van de partij.
• Proceswater: wassen van grondstoffen, koeling, reiniging van apparatuur en oppervlakken. Hier zijn totale coliformen een vroeg waarschuwingssignaal voor biofilms in tanks, slangen of recirculatiecircuits.

Representatieve bemonsteringspunten vastleggen (inlaat van de fabriek, uitlaat van tanks, gebruikspunten) en de trends in de tijd volgen is net zo belangrijk als de grenswaarde. Bedenk ook dat deze resultaten worden uitgedrukt als aanwezigheid/afwezigheid of als telling per watervolume, niet als de KVE per gram die bij levensmiddelen gebruikelijk zijn.

Hoe het met moleculaire methoden wordt aangetoond

De referentiemethoden voor deze indicatoren zijn nog steeds kweekmethoden, met incubaties van 24 tot 48 uur plus bevestiging. Real-time PCR maakt het mogelijk de betrokken geslachten aan de hand van hun genetisch materiaal te identificeren en een vroege uitlezing te krijgen die het onderzoek richting geeft. TAAG biedt voor water de kits Ampliora 3.11 WaterScan (Escherichia coli, Citrobacter spp. en Klebsiella spp.), Ampliora 3.12 WaterScan (Enterococcus spp., Enterobacter spp. en Escherichia spp.) en Ampliora 6.1 WaterScan Plus, dat de zes targets in één kit samenbrengt. Omdat PCR geslachten detecteert en de kweekdefinitie van "coliform" of "intestinale enterococ" niet nabootst, vullen de resultaten de door de toepasselijke regelgeving vereiste methoden aan, zonder ze te vervangen.