Onderdeel van de technologiepijler van TAAG. Vult Ampliora, Elevia en Specio en hoe je een TAAG-kit kiest aan.
Inhoudsopgave
Een technisch informatieblad is een contract over het toepassingsgebied
Voordat een laboratorium een PCR-kit koopt of invoert, krijgt het een technisch informatieblad met een tiental velden: formaat, inhoud, fluorescentiekanalen, tijden, gevoeligheid, matrices, compatibele apparatuur, bewaring en soms een certificering. Het beschrijft de omstandigheden waaronder de fabrikant heeft aangetoond dat de methode werkt. Daarbuiten wordt het resultaat niet meer door de validatie gedekt.
Dit artikel loopt die velden door met echte voorbeelden uit de catalogus van TAAG, toepasbaar op het informatieblad van elke leverancier. De verschillen tussen de productlijnen staan in Ampliora, Elevia en Specio en de keuze per sector in hoe je een TAAG-kit kiest.
Formaat en inhoud: wat er in de doos zit
Op het informatieblad van Ampliora 1.1 Salmonella spp. (code V-SF97) is het opgegeven formaat SPID, voor 96 reacties, en bestaat de inhoud uit 12 voorgevulde PCR-strips, een buisje positieve controle van 100 µL en een buisje negatieve controle van 352 µL. Specio 4.1 (V-SF95) wordt geleverd voor 480 reacties, met 60 voorgevulde strips en vijf buisjes van elke controle.
Twee punten verdienen aandacht:
- Wat inbegrepen is en wat niet. Wat niet in de doos zit (ophopingsmedium, extractiekit), maakt evengoed deel uit van de methode. Het informatieblad van Ampliora 1.1 noemt als gerelateerde producten het medium Augmentis 14 Universal Gram negative, de extractiekit Nucleia 2 Tez-Q Plus en de bemonsteringskit Collectio 1 NeutroSampling. Ze vervangen verandert het beoordeelde protocol.
- De controles. Daarmee weet je of de run geldig was, zoals wordt uitgelegd in controles bij een PCR.
Detectiechemie en fluorescentiekanalen
Probes of intercalerende fluorofoor
Het veld voor de chemie geeft aan hoe het signaal ontstaat. De informatiebladen van Ampliora vermelden fluorescente probes: een gelabeld oligonucleotide dat binnen de doelsequentie hybridiseert en signaal geeft naarmate het product zich ophoopt. Holland en collega's beschreven in 1991 dit type specifieke detectie tijdens de amplificatie. De informatiebladen van Specio vermelden daarentegen een intercalerende fluorofoor, die zich aan elk dubbelstrengs DNA bindt. Daarom voegen die kits een smeltcurveanalyse toe: volgens Ririe, Rasmussen en Wittwer (1997) hangen de vorm en de positie van die curve af van het GC-gehalte, de lengte en de sequentie van het product, en maken ze het mogelijk producten te onderscheiden waarvan de smelttemperaturen minder dan 2 °C verschillen.
Wat FAM, HEX, ROX of Cy5 betekenen
Het zijn de namen van de fluoroforen, en elk wordt in een ander optisch kanaal van de thermocycler gelezen. Een kit met probes wijst aan elk doelwit een kanaal toe en, als er een controle in zit, een ander aan die controle. Enkele letterlijke voorbeelden uit de catalogus:
- Ampliora 1.1 Salmonella spp.: FAM en HEX.
- Ampliora 3.5 (Salmonella spp., L. monocytogenes en Listeria spp.): FAM, HEX, ROX en Cy5.
- Ampliora 3.9 (STEC, E. coli O157:H7 en Salmonella spp.): FAM, HEX, ROX, Cy5 en Cy5.5.
- Specio 4.1 (Salmonella spp., L. monocytogenes, E. coli en S. aureus): alleen FAM, omdat de smeltcurve het onderscheid maakt en niet de kleur.
De praktische vraag is of jouw apparaat die kanalen leest. Bij een kit voor één doelwit met twee kanalen, zoals Ampliora 1.1, moeten het informatieblad of de bijsluiter aangeven welk kanaal bij het micro-organisme hoort en welk bij een controle.
Compatibele thermocyclers
Dit veld vermeldt op welke apparaten de prestaties zijn geverifieerd. Een multiplexkit is afhankelijk van een apparaat met een optisch kanaal voor elke fluorofoor: Ampliora 3.9 gebruikt er vijf, zodat de thermocycler alle vijf moet lezen, en het informatieblad vermeldt de Bio-Rad CFX96.
De catalogus van TAAG bevat een geval dat laat zien waarom dit veld ertoe doet. Ampliora 3.5 (V-SF59) vermeldt de Agilent AriaMx en de Bio-Rad CFX96, naast Open qPCR, met FAM, HEX, ROX en Cy5. Ampliora 3.5R (V-SF74) zoekt dezelfde drie micro-organismen, maar vermeldt het QuantStudio 5 Real-Time PCR System en gebruikt FAM, VIC, ROX, TAMRA en Cy5, met een PCR-tijd van 110 minuten in plaats van 100. Het is hetzelfde panel, aangepast aan een ander platform: ze zijn niet uitwisselbaar.
Staat de thermocycler van het laboratorium niet op het informatieblad, dan is dat gebruik niet gevalideerd en moet je het bewijs bij de fabrikant opvragen.
PCR-tijd en incubatietijd: niet hetzelfde
De PCR-tijd zegt het minst over wanneer het resultaat er is. Op het informatieblad van Ampliora 1.1 staat een PCR-tijd van 100 minuten en, in het veld voor incubatie, een streepje. Dat betekent niet dat er geen ophoping is: de PCR-kit omvat die niet. De ophoping staat op het informatieblad van het bijbehorende medium, Augmentis 14 Universal Gram negative, dat 24 ± 2 uur incubatie vermeldt. Het medium Augmentis 91 BPW, dat bij Ampliora 3.9 hoort, vermeldt 24 ± 2 uur in het algemeen en ten minste 8 uur voor cacaomonsters.
Om de tijd tot het resultaat te schatten, moet je ten minste drie informatiebladen optellen: dat van het medium, dat van de extractiekit en dat van de PCR-kit, plus de bewerkingstijd. De PCR-tijden in de catalogus lopen van 80 minuten (Ampliora 4.7 Low-pH Microorganisms) tot 120 minuten (bijvoorbeeld de Specio-kits); Elevia 1.1, op RNA, vermeldt 95 minuten, evenveel als Ampliora 2.3.
Gevoeligheid: wat "1 kve/25 g" betekent
De gevoeligheid van een kwalitatieve kit wordt bijna altijd uitgedrukt ten opzichte van een analyseportie: Ampliora 1.1, Ampliora 3.5 en Specio 4.1 vermelden 1 kve/25 g in levensmiddelen; Ampliora 3.9 en Elevia 1.1 1 kve/375 g. Voor oppervlakken drukken de informatiebladen van Ampliora 1.1, Ampliora 3.5, Specio 4.1 en Elevia 1.1 de gevoeligheid per monster uit: 1 kve/monster. Het betekent niet dat de PCR één cel in de buis detecteert, maar dat het volledige protocol, inclusief ophoping, die besmetting in die portie detecteert. Daarom zijn 375 g en 25 g niet vergelijkbaar zonder naar het ophopingsprotocol van elk te kijken.
Sommige informatiebladen onderscheiden twee gevoeligheden. Ampliora 4.3 Yeast vermeldt 1x10⁰ kve/mL in opgehoopt monster en 1x10³ cellen/mL in direct monster: twee verschillende getallen die je niet mag verwarren. En de WaterScan-panels drukken hun gevoeligheid uit als een bereik, van 5x10⁰ tot 5x10¹ kve/mL.
LOD, LOD50 en RLOD
Bij een kwalitatieve methode is detectie op zeer lage niveaus probabilistisch: met weinig cellen per portie bevatten sommige porties ze wel en andere niet. ISO 16140-2 vergelijkt het detectieniveau van de alternatieve methode met dat van de referentiemethode via de RLOD, die de norm definieert als het quotiënt van beide LOD's. De studie gebruikt kunstmatig besmette monsters op ten minste drie niveaus; het lage niveau ligt idealiter op het theoretische detectieniveau, 0,7 kve per portie, en moet met de referentiemethode tussen 25 % en 75 % positieven opleveren. De aanvaardbaarheidsgrens is 1,5 bij gepaarde studies en 2,5 bij ongepaarde; een LOD die lager is dan die van de referentie, wordt altijd aanvaard. AOAC drukt de prestatie op haar beurt uit als detectiekans (POD): het aandeel positieve resultaten voor een gegeven matrix en analytniveau. De LOD50 en de onzekerheid daarvan worden behandeld in detectiegrens en LOD50.
Inclusiviteit en exclusiviteit: specificiteit in getallen
Een informatieblad kan "detectie van Salmonella spp." vermelden, maar die zin steunt op een concrete studie:
- Inclusiviteit. Het vermogen van de methode om het doelorganisme in een breed scala aan stammen te detecteren. ISO 16140-2 eist ten minste 50 reincultures van het doelwit en, voor Salmonella-methoden, ten minste 100 culturen van verschillende serotypen. Elke stam wordt geënt op een niveau van 10 tot 100 keer het minimale detectieniveau van de methode en verwerkt met het volledige protocol, inclusief ophoping.
- Exclusiviteit. Het ontbreken van interferentie door relevante niet-doelstammen. ISO 16140-2 eist ten minste 30 niet-doelreincultures. AOAC definieert het als een studie met mogelijk reactieve niet-doelstammen die niet mogen worden gedetecteerd.
De norm vraagt bovendien de stammen te kiezen op basis van het meetprincipe van de methode. Bij het lezen van een informatieblad is de nuttige vraag met hoeveel stammen en serotypen de detectie is aangetoond en tegen welke niet-doelwitten. Dat gegeven staat meestal in het validatierapport, niet in het beknopte informatieblad, en het is redelijk het op te vragen.
Gevalideerde matrices: het veld dat het werkelijke toepassingsgebied bepaalt
De matrices op de informatiebladen van TAAG zijn concreet. Ampliora 1.1 vermeldt rauwe kippendij, diepvriesrundvleesburger, worst (longanicilla), mortadella en oppervlak. Ampliora 3.9 vermeldt kool, sla, spinazie, een mengsel van bladgroenten (sla, kool en spinazie in gelijke delen) en rauw rundergehakt (80 % mager). Specio 4.1 vermeldt een lange reeks bereide levensmiddelen, vlees, zuivelproducten, gepasteuriseerd vloeibaar ei en levende en inerte oppervlakken, en zijn AOAC-matrices zijn roestvrijstalen oppervlakken, gepasteuriseerde vloeibare melk met 2 % vet en bladgroente (sla). Elevia 1.1 vermeldt gevulde chocolade van het hazelnoot- en melktype, chocoladereep met pinda's, hazelnoot- en cacaocrème, heel spiervlees, rundergehakt (90 % mager), diervoederpellets, gepasteuriseerd vloeibaar ei en roestvrijstalen oppervlakken.
Dat is om twee redenen belangrijk. De eerste is inhibitie: een review van het Duitse Bundesinstitut für Risikobewertung (Schrader en collega's, 2012) beschrijft dat remmende stoffen in het monster de gevoeligheid van de PCR kunnen verlagen of fout-negatieven kunnen veroorzaken, en dat sommige eigen zijn aan bepaalde soorten monsters, wat matrixspecifieke extractieprotocollen noodzakelijk maakt. De tweede is de begeleidende flora en de toestand van de cellen: ISO 16140-2 vraagt dat een validatie producten met een hoge en een lage achtergrondflora, verschillende processtress en rauwe producten omvat.
De norm legt ook het toepassingsgebied vast: als een methode wordt opgegeven voor een "breed scala aan levensmiddelen", moeten ten minste vijf categorieën worden onderzocht, met ten minste drie typen per categorie. Verordening (EG) nr. 2073/2005 staat alternatieve methoden toe die tegen de referentiemethode zijn gevalideerd en, als ze eigendomsmethoden zijn, door een derde partij zijn gecertificeerd volgens ISO 16140 of andere vergelijkbare internationale protocollen. Staat jouw product niet tussen de matrices, dan zegt het informatieblad niet dat de kit faalt: het zegt dat nog niemand het heeft aangetoond. De verificatie in het eigen laboratorium, volgens ISO 16140-3, wordt uitgelegd in validatie en verificatie van methoden.
Bewaring en houdbaarheid
Alle PCR-kits in de catalogus van TAAG worden bewaard tussen -25 °C en -15 °C. De opgegeven houdbaarheid is 9 maanden voor de meeste (bijvoorbeeld Ampliora 1.1, Ampliora 3.9 en Specio 4.1) en 6 maanden voor de Elevia-kits. De media hebben eigen voorwaarden: Augmentis 14 wordt bewaard tussen 2 °C en 25 °C met 6 maanden houdbaarheid, en Nucleia 2 Tez-Q Plus tussen 2 °C en 25 °C met 12 maanden. De kortste houdbaarheid van het geheel bepaalt de inkoop.
Certificeringen en versie van het informatieblad
Ampliora 3.9 vermeldt "Certified by AOAC by extension of License Number 032501" en Specio 4.1 "Certified by AOAC by extension of License Number 072101". Het informatieblad van Elevia 1.1 dat op taag.bio is gepubliceerd, voegt "Certified by AOAC by extension of License Number 072601" toe, met een PTM-toepassingsgebied van chocolade met 62 % cacao, cacaomassa, mageremelkpoeder en pinda's (elk 375 g) en roestvrijstalen oppervlakken van 100 cm², zonder het protocol "zero". Het gecertificeerde toepassingsgebied en de lijst van gevalideerde matrices zijn verschillende velden en hoeven niet samen te vallen. Het woord "extension" geeft aan dat het toepassingsgebied van een bestaande licentie is uitgebreid, en elke certificering dekt de matrices en doelwitten die in die studie zijn beoordeeld, zoals wordt uitgelegd in wat AOAC-PTM-certificering is. Bij een audit moet je het licentienummer, de gecertificeerde matrices en de werkelijke matrix van het laboratorium naast elkaar leggen.
De informatiebladen hebben ook een revisienummer en -datum. Dat van Ampliora 1.1 staat bijvoorbeeld op revisie 4, van 7 oktober 2025. Het is raadzaam de geldende versie samen met de verificatieregistraties te archiveren.
Welke TAAG-kits en -technologie in dit artikel voorkomen
Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97) en Ampliora 3.9 (V-SF68) zijn realtime PCR's met fluorescente probes die met Mila zijn ontworpen; Specio 4.1 (V-SF95) gebruikt een intercalerende fluorofoor met een smeltcurve die met KAi wordt geïnterpreteerd; Elevia 1.1 Salmonella spp. (V-PAT04) is een RT-qPCR op RNA met AiGOR-technologie. In alle vier gevallen vermeldt het informatieblad dat de software TxA de curves automatisch interpreteert. Komen de matrix of het apparaat van het laboratorium niet overeen met de opgegeven, dan moet je verifiëren voordat je het resultaat gebruikt.
Conclusie
Het technische informatieblad van een PCR-kit beschrijft de omstandigheden waaronder de methode is aangetoond: met welk medium en welke extractie, op welk apparaat en met welke kanalen, voor welke portie en welke matrices, en met welke studie naar inclusiviteit, exclusiviteit en detectieniveau. Het goed lezen betekent de PCR-tijd scheiden van de totale tijd, begrijpen dat de gevoeligheid verwijst naar een portie en een volledig protocol, en de matrices en de certificering naast wat het laboratorium werkelijk analyseert leggen. Als iets niet overeenkomt, zegt het informatieblad niet dat de kit faalt, maar dat verificatie nodig is voordat je op basis van het resultaat beslist.
Over TAAG
Neem met TAAG het technische informatieblad van Ampliora 1.1 Salmonella spp., Ampliora 3.9 of Specio 4.1 door ten opzichte van jouw matrix en jouw thermocycler.
Veelgestelde vragen
Is de PCR-tijd op het informatieblad de totale tijd tot het resultaat?
Nee. De PCR-tijd betreft alleen de run in de thermocycler. Bij de totale tijd komen de ophoping, die op het informatieblad van het kweekmedium staat (bijvoorbeeld 24 ± 2 uur bij Augmentis 14 Universal Gram negative), de extractie en de bewerking.
Wat betekent een gevoeligheid van 1 kve/25 g?
Dat het volledige protocol, met de ophoping, het micro-organisme detecteert uitgaande van die besmetting in een portie van 25 g. Het betekent niet dat de PCR één enkele cel in de buis detecteert, en detectie op zulke lage niveaus is probabilistisch, waardoor de normen haar beoordelen met LOD50, RLOD of POD.
Wat zijn de inclusiviteit en de exclusiviteit van een kit?
Inclusiviteit is het vermogen om het doelorganisme in veel verschillende stammen te detecteren; ISO 16140-2 eist ten minste 50 stammen, en 100 serotypen bij Salmonella. Exclusiviteit betekent dat de methode niet reageert op relevante niet-doelstammen; de norm eist er ten minste 30.
Mag ik een kit gebruiken in een matrix die niet op het informatieblad staat?
Dat mag, maar dat gebruik wordt niet gedekt door de validatie van de fabrikant. Voordat het resultaat wordt gebruikt om te beslissen, moet het laboratorium de methode in zijn matrix verifiëren, bijvoorbeeld volgens ISO 16140-3, omdat PCR-inhibitie en begeleidende flora per levensmiddel verschillen.
Werkt een kit op elke realtime thermocycler?
Niet per se. Het apparaat moet de fluorescentiekanalen lezen die de kit gebruikt en behoren tot de apparaten waarop de prestaties zijn geverifieerd. In de catalogus van TAAG zoeken Ampliora 3.5 en Ampliora 3.5R dezelfde micro-organismen, maar vermelden ze verschillende platforms en fluoroforen.