Dit artikel brengt wat wordt gepresenteerd in controles bij een PCR en in nucleïnezuurextractie naar de levensmiddelenmatrix.
Inhoudsopgave
Een negatief resultaat betekent niet altijd afwezigheid
Bij een realtime-PCR is een negatief resultaat het ontbreken van een stijgende curve. Dat ontbreken kan komen doordat het micro-organisme niet in het monster zat, maar ook doordat iets uit het levensmiddel verhinderde dat de reactie werkte. Die stoffen worden PCR-remmers genoemd. Het overzicht van Sidstedt, Rådström en Hedman (2020) definieert ze als moleculen uit de matrix, uit de cellen zelf of uit de reagentia die tijdens de voorbereiding worden toegevoegd, die de DNA-polymerisatie of het fluorescentiesignaal beïnvloeden.
Voor een levensmiddelenlaboratorium is het risico concreet: een remmer die onopgemerkt blijft, maakt van een besmette partij een rapport "niet aangetoond". Dit artikel richt zich op de matrix: welke bestanddelen van levensmiddelen remmen, hoe remming wordt herkend en wat je kunt doen om haar te voorkomen. De controles van een run worden uitvoerig uitgelegd in controles bij een PCR en de zuiveringsstappen in nucleïnezuurextractie.
Drie manieren om een reactie te blokkeren
Sidstedt en collega's delen de mechanismen in drie groepen in. Ze onderscheiden helpt de juiste oplossing te kiezen.
Remmers van de polymerase
Ze werken rechtstreeks op het enzym, door eraan te binden of het af te breken, of door het ionengehalte te veranderen dat het nodig heeft. Hemoglobine en hematine, afgeleid van de heemgroep uit bloed, verlagen de activiteit van de polymerase en daarmee de amplificatie-efficiëntie. Galzouten en fytinezuur in feces worden eveneens beschreven als directe remmers van het enzym, en fenolen die uit een zuivering zijn meegekomen, kunnen het denatureren.
Remmers die aan nucleïnezuren binden
Andere verbindingen binden aan het template-DNA en verhinderen dat de primers zich hechten of dat het enzym voortschrijdt. Dat is het geval bij immunoglobuline G uit bloed, dat aan enkelstrengs DNA bindt en de start van de amplificatie vertraagt, en bij collageen uit bot, dat met het template-DNA interageert.
Remmers van de detectie
Sommige moleculen remmen de amplificatie niet, maar doven de fluorescentie. In de besproken studies verzwakten humuszuur en hemoglobine het signaal van kleurstoffen die aan dubbelstrengs DNA binden (SYBR Green I, EvaGreen) en van de referentiekleurstof ROX, terwijl detectie met hydrolyseprobes tegenover humuszuur dat effect niet vertoonde. In de praktijk kan er geamplificeerd product zijn en toch een zwakke of ontbrekende curve. De chemie van elke kitlijn wordt beschreven in Ampliora, Elevia en Specio: welke chemie elke lijn gebruikt.
De typische remmers van elke matrix
Cacao, chocolade en specerijen: polyfenolen
Chocolade en zwarte peper worden in het onderzoek naar polymerasen gebruikt als referentieremmers. In een werk uit 2025 bereidden Kermekchiev en collega's waterige oplossingen van pure chocolade (70 % cacao) en zwarte peper en stelden vast dat fracties van een microliter van die oplossingen de conventionele Taq-polymerase sterk of volledig remden bij het amplificeren van een Salmonella-gen. De auteurs achten het aannemelijk dat fenolische en polyfenolische verbindingen een gemeenschappelijke remmer zijn van chocolade, peper, plantenextracten en humuszuur.
In veel plantaardige materialen komen bij de polyfenolen de polysachariden. Extractieprotocollen voor planten die rijk zijn aan beide groepen verbindingen, pakken ze afzonderlijk aan: een hoge zoutconcentratie (1,4 M) zodat de polysachariden niet in het extract terechtkomen, en polyvinylpyrrolidon (PVP) om de polyfenolen vast te houden, zoals Rezadoost en collega's (2016) beschrijven. Het verband van deze matrices met Salmonella wordt behandeld in Salmonella in levensmiddelen met een lage vochtigheid.
Melk en kaas: eerder het calcium dan het vet
Een gangbare intuïtie is de remming door melk toe te schrijven aan het vet. Bickley en collega's (1996) zagen dat zonder voorbehandeling de amplificatie van Listeria monocytogenes faalde bij meer dan 5 % melk in de reactie, en dat de remming bij dezelfde concentraties optrad met volle, halfvolle en magere melk. De belangrijkste geïdentificeerde veroorzaker waren de calciumionen. Het effect werd deels omgekeerd door het magnesium in de reactie ver boven het gebruikelijke te verhogen, wat wijst op concurrentie met het magnesium dat de polymerase nodig heeft. Kaas staat ook tussen de bekende remmende monsters waarmee Al-Soud en Rådström (1998) negen polymerasen vergeleken.
Vlees, bloed en fecale monsters
In vlees en vleesproducten brengt het bloed hemoglobine, hematine, immunoglobuline G en lactoferrine mee, allemaal beschreven als remmers. Rossen en collega's (1992) vonden bovendien dat de PCR gevoelig was voor grote volumes van complexe levensmiddelenmonsters met veel vet en eiwit. In monsters met fecale inhoud, zoals die uit de primaire productie, komen daar de eerder genoemde galzouten en fytinezuur bij.
Ook het laboratorium zelf brengt remmers in
Niet alles komt uit het levensmiddel. Rossen en collega's stelden vast dat sommige kweekbouillons (Fraser, Rappaport, MLEB en MRB) met de PCR interfereerden, en dat reagentia die bij de extractie worden gebruikt, zoals detergenten, lysozym, NaOH, alcoholen of EGTA, een zeker remmend effect hadden. Daarom moet de combinatie van bouillon voor ophoping, extractiemethode en PCR-reagentia als geheel worden beoordeeld.
Hoe remming wordt opgespoord
Wat de norm vraagt
Bijna twintig jaar lang was het ISO-kader over meerdere normen verdeeld: ISO 20837:2006 stelde de eisen voor het bereiden van PCR-compatibele monsters vast en ISO 20838:2006 de eisen voor amplificatie en detectie bij kwalitatieve methoden. Beide werden, samen met ISO 22119:2011 en ISO 22174:2005, vervangen door ISO 22174:2024 (tweede editie, augustus 2024), die de algemene eisen vastlegt voor PCR voor micro-organismen en virussen in de voedselketen, inclusief levensmiddelen, diervoeders, omgevingsmonsters uit de productie en monsters uit de primaire productie. Wie in een interne procedure nog ISO 20837 of ISO 20838 aanhaalt, zou de verwijzing moeten bijwerken.
De interne amplificatiecontrole en haar grenzen
Het gebruikelijke instrument is de interne amplificatiecontrole (IAC), een sequentie die losstaat van het doelwit en in hetzelfde buisje wordt geamplificeerd. De leeslogica ervan staat in controles bij een PCR. Vanuit het oogpunt van de matrix is het goed twee nuances in gedachten te houden die het overzicht van Sidstedt aanstipt:
- Niet alle assays worden even sterk geremd. Verschillende primers en doelwitten kunnen op een andere manier worden beïnvloed, en lange fragmenten zijn doorgaans gevoeliger dan korte. Een goed ontworpen IAC moet de remming weerspiegelen die het doelwit zou ondergaan.
- Gedeeltelijke remming is in de curve te zien. Naast de IAC kan de amplificatiekinetiek van het doelwit zelf worden bekeken. Een Ct die achterblijft of een efficiëntie die daalt, zijn vroege signalen, zoals uitgelegd in Ct-waarde bij realtime-PCR.
Bij de validatie van methoden duikt de IAC vaak op in moeilijke matrices. McCabe en collega's (2011) valideerden een realtime-PCR voor Salmonella met een mee-geamplificeerde IAC om remmers te bewaken, en de methode presteerde even goed als de referentiekweek in kunstmatig besmette monsters van salade, chocolade, vis en kaas.
Het gespikete monster
De IAC verifieert de amplificatie, maar niet de extractie of de ophoping. Daarvoor dient een monster van dezelfde matrix dat met het micro-organisme is gespiket (matrix spike). Het Salmonella-hoofdstuk van het Bacteriological Analytical Manual (BAM) van de FDA bepaalt dat, als een gespiket monster bij de moleculaire screening negatief uitvalt, het monster verder via kweek moet worden onderzocht.
Hoe remming wordt beperkt
Verdunnen
Het is de eenvoudigste maatregel. Het BAM geeft aan dat bij screeningresultaten die op remming wijzen, de analyse met verdund template-DNA wordt herhaald. Verdunning verlaagt de remmer en het doelwit in dezelfde verhouding: ze werkt wanneer de remmer onder een bepaalde concentratie niet meer actief is en er nog voldoende doelwit overblijft. Als het doelwit dicht bij de detectielimiet ligt, kan verdunnen het onzichtbaar maken.
Ophopen, en de preënrichting verzorgen
De ophoping verdunt de matrix en vermenigvuldigt tegelijk het doelwit. Bij sommige levensmiddelen is het obstakel niet alleen de PCR maar de groei: het BAM schrijft voor chocolade voor te verrijken in gereconstitueerde magere melk met briljantgroen, piment, kaneel en oregano in een verhouding van 1:100 te analyseren en kruidnagel in 1:1.000, omdat er geen bekende methode is om de toxiciteit van die specerijen te neutraliseren, en kaliumsulfiet aan de bouillon toe te voegen voor ui en knoflook. Als Salmonella niet in de bouillon groeit, heeft de PCR niets te detecteren.
Beter extraheren, zonder DNA te verliezen
Een voorbehandeling of een extractiekit die is ontworpen voor complexe matrices, verwijdert remmers die een eenvoudige lysis doorlaat. Rossen en collega's verminderden het effect van vet- en eiwitrijke levensmiddelen significant met een behandeling met NaOH en SDS onder verhitting. Zuiveren heeft een prijs: volgens Sidstedt en collega's ligt de DNA-opbrengst bij uitgebreide zuiveringen doorgaans tussen 10 % en 80 %, zodat overmatig opschonen ook fout-negatieven kan veroorzaken.
Een tolerante polymerase kiezen en de mix aanpassen
Polymerasen verdragen remmers niet in gelijke mate. Al-Soud en Rådström (1998) vergeleken negen enzymen: AmpliTaq Gold en Taq werden volledig geremd door 0,004 % (v/v) bloed, terwijl HotTub, Pwo, rTth en Tfl zonder verlies aan gevoeligheid amplificeerden met 20 % bloed. De polymerase van Thermotoga maritima werd het sterkst beïnvloed door kaas, feces en vlees. Tegenwoordig bestaan er bovendien Taq-mutanten die zijn geselecteerd op hun resistentie tegen chocolade en peper. Ook facilitatoren helpen: runderserumalbumine (BSA), gebruikt in hoeveelheden van 0,2 tot 20 µg per reactie, gaat verscheidene remmers van de polymerisatie tegen, hoewel het de uitdoving van fluorescentie door humuszuur niet corrigeerde, en trehalose stabiliseert het enzym.
Valideren in de echte matrix
Geen van deze maatregelen vervangt de validatie: matrixeffecten moeten worden onderzocht met de monstertypen die het laboratorium werkelijk analyseert. Hoe die beoordeling wordt opgezet, wordt uitgelegd in validatie en verificatie van methoden volgens ISO 16140.
Welke TAAG-kits en -producten hiermee verband houden
In de TAAG-catalogus zijn er twee producten die specifiek op remming zijn gericht. Clarixa 1 (V-PET02) is een voorbehandeling vóór de extractie voor monsters uit zeer complexe matrices, beschreven als middel om PCR-remmers te verminderen. Nucleia 2 Tez-Q Plus (V-EQ19) is een kit voor de extractie van bacteriële nucleïnezuren voor complexe matrices met een hoge concentratie remmers. Onder de detectiekits vermeldt Elevia 1.1 Salmonella spp. (V-PAT04, RT-qPCR met probes) als gevalideerde matrices gevulde chocolade, chocoladereep met pinda's, hazelnoot- en cacaocrème, vlees, diervoederpellets, gepasteuriseerd vloeibaar ei en roestvrijstalen oppervlakken, en zijn informatieblad noemt Magneus 6 Bacteria en Nucleia 8 Ultra als extractiebenodigdheden. Specio 00.1 Bacteria (V-SF14), een bederfkit met smeltcurve, vermeldt onder zijn matrices chocolademelk, ketchup, mosterd en met calcium verrijkte melk (130 mg/100 mL). Buiten de aangegeven matrices moet de prestatie tegenover remmers met TAAG worden bevestigd voordat je hem routinematig gebruikt.
Conclusie
Een fout-negatief door remming laat geen spoor na als niemand ernaar zoekt, en elke matrix brengt haar eigen remmers mee: polyfenolen in cacao en specerijen, calcium in melk, heem en immunoglobulinen in vlees met bloed, galzouten in fecale monsters, en zelfs bestanddelen van de bouillons en reagentia zelf. Remming wordt herkend met een interne amplificatiecontrole, met het lezen van de kinetiek van de curve en met gespikete monsters, binnen het kader dat ISO 22174:2024 nu samenbrengt. Ze wordt beperkt door verdunning, een op de matrix afgestemde ophoping, een extractie die zuivert zonder DNA te verliezen en een tolerante polymerase te combineren, en ze wordt aangetoond door de methode te valideren in de levensmiddelen die het laboratorium werkelijk analyseert.
Over TAAG
Vraag TAAG of Clarixa 1 of Nucleia 2 Tez-Q Plus bij je matrix passen, en wat het gevalideerde toepassingsgebied van Elevia 1.1 Salmonella spp. in cacao en chocolade is.
Veelgestelde vragen
Wat is een PCR-remmer?
Het is elke stof uit het monster, de cellen of de reagentia die de amplificatie van DNA of het uitlezen van de fluorescentie verstoort. Ze kan op de polymerase inwerken, aan het template-DNA binden of het signaal doven. Het ernstigste gevolg is een fout-negatief.
Waarom remmen chocolade en specerijen de PCR?
De remming wordt vooral toegeschreven aan fenolische en polyfenolische verbindingen, die de polymerase verstoren. In een studie uit 2025 met pure chocolade en zwarte peper volstonden fracties van een microliter van waterige oplossingen van die levensmiddelen om de conventionele Taq-polymerase sterk of volledig te remmen.
Is het vet in melk wat de PCR remt?
Niet in de eerste plaats. Bickley en collega's zagen dezelfde remming met volle, halfvolle en magere melk, en schreven het effect vooral toe aan de calciumionen, die concurreren met het magnesium in de reactie.
Zijn ISO 20837 en ISO 20838 nog van kracht?
Nee. Beide normen uit 2006 werden ingetrokken en vervangen door ISO 22174:2024, die de algemene eisen voor PCR voor micro-organismen in de voedselketen samenbrengt. Interne procedures zouden die laatste moeten aanhalen.
Wat doe ik als ik remming in een monster vermoed?
De analyse herhalen met verdund DNA is de eerste stap die het BAM van de FDA aangeeft. Als het aanhoudt, is het goed de extractie te verbeteren of een voorbehandeling voor complexe matrices te gebruiken, en als het resultaat onbepaald blijft, de analyse via kweek af te ronden.