Dit artikel volgt het monster na transport en bewaring van monsters en vult de attributenbemonsteringsplannen aan met wat er in het laboratorium gebeurt.
Inhoudsopgave
De stap die niemand in het rapport ziet
Een microbiologisch resultaat wordt gerapporteerd als "afwezig in 25 g" of "3.200 KVE/g", maar tussen de zak die het laboratorium binnenkomt en de plaat of de bouillon ligt een stap die bijna nooit in het rapport verschijnt: de voorbereiding van het monster. Hoeveel wordt afgewogen, in welke verdunningsvloeistof, hoe lang wordt gehomogeniseerd, hoe lang de suspensie wacht en of porties worden samengevoegd: elke beslissing verandert wat het getal betekent. De bemonstering in de fabriek staat in oppervlaktebemonstering en het vervoer naar het laboratorium in transport en bewaring van monsters; dit artikel begint waar die eindigen, met het monster al ontvangen.
De internationale referentie voor deze stap is de reeks ISO 6887, van comité ISO/TC 34/SC 9. Ze bestaat uit zes delen: 6887-1:2017 legt de algemene regels vast en de andere vijf werken die uit voor productgroepen: vlees (6887-2:2017), vis en visserijproducten (6887-3:2017), diverse producten zoals eieren, groenten, cacao, kruiden en specerijen (6887-4:2017), melk en zuivelproducten (6887-5:2020) en monsters uit de primaire productie, van boerderij tot slachthuis (6887-6:2013). Als de specifieke methode voor een micro-organisme eigen instructies bevat, hebben die voorrang.
De initiële suspensie 1:10, stap voor stap
Afwegen en verhouding
ISO 6887-1 vraagt de analytische portie af te wegen of af te meten met een tolerantie van ±5 %, met een minimum van 10 g of 10 mL tenzij de methode anders aangeeft, en daar 9 keer die hoeveelheid verdunningsvloeistof aan toe te voegen, bij voorkeur op massa afgemeten met een tolerantie van ±2 %. Zo ontstaat de verdunning 1:10. De norm staat andere verhoudingen toe wanneer dat nodig is: 1 op 20, 1 op 50 of 1 op 100 voor producten die te dikke suspensies geven, en 1 op 2 of 1 op 5 wanneer lage tellingen worden gezocht, hoewel ze waarschuwt dat die laatste de verhouding tussen inoculum en medium uit balans kunnen brengen en per geval moeten worden geverifieerd. Elke niet-standaard verhouding werkt door in de eindberekening.
Verdunningsvloeistoffen
Voor algemeen gebruik definieert de norm twee verdunningsvloeistoffen: de peptonzoutoplossing (1 g enzymatisch caseïnedigest en 8,5 g natriumchloride per liter) en het gebufferd peptonwater, beide met een eind-pH van 7,0 ± 0,2 bij 25 °C. Daarnaast bestaat er een versie van gebufferd peptonwater met dubbele concentratie voor zeer zure producten. Het eindvolume mag niet meer dan ±2 % afwijken en de verdunningsvloeistoffen moeten een prestatietest doorstaan: na 45 minuten tot 1 uur bij kamertemperatuur moet de telling van de controlestam binnen ±30 % van de begintelling blijven. De prestatie-eisen voor verdunningsvloeistoffen en media worden uitgewerkt in ISO 11133.
Homogeniseren
Het mengsel wordt gehomogeniseerd volgens ISO 7218 (vierde editie, uit 2024), met een roterende homogenisator (laboratoriumblender) of een peristaltische, het toestel met peddels dat op een steriele zak slaat en in laboratoria meestal stomacher wordt genoemd. Indien nodig laat je grote deeltjes tot 15 minuten bezinken; zakken met geïntegreerd filter zijn een gelijkwaardig alternatief. Voor harde of droge producten beperkt de norm de roterende homogenisator tot 2,5 minuten aaneen en het vooraf hakken of malen tot 1 minuut, om te voorkomen dat het monster opwarmt. Het handboek van de FDA voor levensmiddelen (BAM, hoofdstuk 1) gebruikt voor tellingen 50 g monster in 450 mL fosfaatverdunningsvloeistof van Butterfield, 2 minuten geblend.
Maximale tijden
ISO 6887-1 bepaalt dat tussen het einde van de bereiding van de initiële suspensie en het contact van het inoculum met het uiteindelijke kweekmedium niet meer dan 45 minuten mogen verstrijken, en tussen de initiële suspensie en het begin van de verdunningen niet meer dan 30 minuten. Als het in het laboratorium warmer is dan 27 °C, zouden beide tijden korter moeten zijn. Het BAM is strenger: niet meer dan 15 minuten van het homogeniseren tot alle verdunningen in hun media zitten. In een voedingsrijke suspensie kunnen de micro-organismen zich beginnen te vermenigvuldigen en valt het resultaat hoger uit dan het werkelijke monster.
Decimale verdunningen
Voor elke decimale stap wordt 1 mL ± 0,02 mL overgebracht naar een buis met 9 mL ± 0,2 mL verdunningsvloeistof, zonder de pipet meer dan 1 cm onder te dompelen, 5 tot 10 seconden mengend en met een nieuwe tip bij elke stap.
Regels per type levensmiddel
Diepgevroren producten
Voor kleine verpakkingen (doorgaans minder dan 2 kg) staat ISO 6887-1 toe ze op een consistentie te brengen waarbij de portie kan worden genomen, bij 18-27 °C gedurende maximaal 3 uur of bij 5 ± 3 °C gedurende maximaal 24 uur, en ontraadt ze ontdooien in een waterbad of onder de kraan, vanwege het besmettingsrisico als de verpakking niet luchtdicht is. Het BAM ontdooit liever niet en doet het, indien nodig, bij 2-5 °C in maximaal 18 uur, of onder 45 °C gedurende niet meer dan 15 minuten met schudden in een thermostatisch waterbad.
Vlees
ISO 6887-2 omvat vers, gekoeld, diepgevroren, gepekeld, gefermenteerd en gehakt vlees, vleesbereidingen, separatorvlees, gekookt, gedroogd en gerookt vlees, geconcentreerde extracten en karkasmonsters genomen door excisie of met een swab. Ze onderscheidt onder meer blokken en stukken, worsten met darm en oppervlakte- of dieptemonsters. De bemonstering van het karkas is het onderwerp van ISO 17604. De context van de sector staat in microbiologie in de vleesindustrie.
Zuivel
ISO 6887-5 heeft eigen procedures voor vloeibare melk, melk- en weipoeder, kaas, caseïnes en caseïnaten (met een bijzonder geval voor stremselcaseïne), boter, consumptie-ijs, zuiveldesserts met een pH boven 5, gefermenteerde melk en yoghurt met een pH onder 5 en zuigelingenvoeding in poedervorm. Het BAM illustreert waarom niet alles op dezelfde manier kan worden behandeld: voor Salmonella in kaas blendt het 25 g met 225 mL lactosebouillon gedurende 2 minuten, laat het 60 minuten staan en stelt het de pH in op 6,8 ± 0,2; instant mageremelkpoeder wordt daarentegen voorzichtig op het oppervlak van de bouillon uitgestrooid en zonder mengen geïncubeerd.
Vis en schaal- en schelpdieren
ISO 6887-3 omvat hele vis of visfilets, schaaldieren, koppotigen, tweekleppige weekdieren, buikpotigen, manteldieren en stekelhuidigen, daarnaast gerookte en gekookte producten en diepgevroren blokken, en bevat bijzondere procedures voor rauwe weekdieren, manteldieren en stekelhuidigen uit primaire productiegebieden.
Droge, zure en vette levensmiddelen
- Lage vochtigheid: eerst de verdunningsvloeistof afwegen en daarna de portie toevoegen, om de osmotische schok te verminderen, en tot 1 uur laten weken als het product hard is. Het BAM voegt bij poeders eerst ongeveer 15 mL bouillon toe, vormt een klontvrije suspensie en vult het volume in porties aan.
- Zuur: de suspensie moet terugkeren naar pH 7,0 ± 0,5. Gebufferd peptonwater volstaat voor producten met een pH van 4,5 of hoger; tussen pH 3,5 en 4,5 kan de versie met dubbele concentratie worden gebruikt, waarbij de pH de eerste keer wordt gecontroleerd.
- Vet (meer dan 20 %): aan de verdunningsvloeistof kan polysorbaat 80 worden toegevoegd, tussen 1 en 10 g/L; in het algemeen volstaat 1 g/L per 10 % vet.
- Remmende specerijen: het BAM voegt 0,5 % kaliumsulfiet toe voor gedroogde ui en knoflook, en verdunt piment, kaneel en oregano tot 1:100 en kruidnagel tot 1:1000, omdat er geen manier bekend is om hun effect te neutraliseren.
Samengesteld en gepoold: niet hetzelfde
Eenheden uit dezelfde partij samenvoegen bespaart werk en reagentia. Amendement 1 uit 2024 op ISO 6887-1 verduidelijkt twee begrippen die in de praktijk door elkaar worden gehaald:
- Samengesteld monster: verscheidene eenheden worden gemengd en uit het mengsel wordt een portie genomen van de grootte die de methode aangeeft, bijvoorbeeld 25 g. Het resultaat wordt nog steeds uitgedrukt in 25 g.
- Gepoold monster (pooling): verscheidene eenheden of porties worden samengevoegd en het volledige mengsel wordt geanalyseerd. Het resultaat wordt uitgedrukt in de totale massa, bijvoorbeeld 100 g of 375 g.
Poolen kan buiten het laboratorium, door afzonderlijke monsters tot een groter monster samen te voegen, of erbinnen, door porties in één grote preënrichting samen te voegen of door reeds gepreënrichte bouillons samen te voegen. Er gelden vaste regels: alleen voor kwalitatieve bepalingen, alleen met eenheden van dezelfde herkomst (dezelfde partij of zending) en zonder twee varianten tegelijk te combineren, bijvoorbeeld porties poolen en vervolgens ook hun bouillons poolen.
25 g of 375 g: wat er verandert als de portie groter wordt
Het klassieke schema komt uit het BAM: van elke monstereenheid wordt een portie van 25 g genomen en tot 15 porties kunnen worden samengevoegd tot een samengesteld monster van 375 g, dat in zijn geheel wordt geanalyseerd met behoud van de verhouding 1:9 (375 g in 3.375 mL bouillon). Het aantal eenheden hangt af van de categorie van het levensmiddel: 60 voor categorie I (zonder letale stap en bestemd voor ouderen, zieken of zuigelingen), 30 voor categorie II en 15 voor categorie III, dat wil zeggen 4, 2 of 1 samengesteld monster van 375 g. Eén enkel positief resultaat leidt tot afkeuring van de partij. Het BAM sluit onder meer niet-instant melkpoeder en volle melkpoeder uit van samenvoeging.
Het amendement van 2024 stelt technische voorwaarden zodat het grote volume geen positief resultaat verbergt:
- De preënrichtingsbouillon moet voorverwarmd zijn tot de incubatietemperatuur.
- Het temperatuurprofiel van het grote volume moet bekend zijn. Met ISO 6579-1 als voorbeeld, waarvan de preënrichting 16 tot 20 uur duurt, moet het mengsel ten minste 16 uur tussen 34 °C en 38 °C worden gehouden, en moet de tijd tot het bereiken van die temperatuur zo kort mogelijk zijn.
- De verhouding monster/verdunningsvloeistof van de gevalideerde methode wordt niet gewijzigd, behalve om haar te verhogen bij remmende matrices zoals uienpoeder, knoflook, oregano, paprika's, sommige theesoorten en koffies, vitaminepremixen of zeer zoute producten.
- Een laboratoriummonster dat groter is dan het maximum, wordt verdeeld: 750 g wordt verwerkt als twee porties van 375 g.
Bovendien moet de grotere omvang gevalideerd zijn. Als dat gebeurde in een studie volgens ISO 16140-2 of ISO 16140-5, hoeft elk laboratorium haar alleen volgens ISO 16140-3 te verifiëren binnen dezelfde levensmiddelencategorie; zo niet, dan moet het haar zelf valideren met het protocol van bijlage H van amendement 1:2024 op ISO 16140-4, waarbij met het relatieve detectieniveau (RLOD) wordt aangetoond dat de LOD50 niet verslechtert. Zodra 375 g is gevalideerd, mogen kleinere porties in dezelfde verhouding worden gebruikt. Deze begrippen worden uitgelegd in validatie en verificatie van methoden.
Het bewijs ondersteunt de aanpak wanneer ze goed wordt uitgevoerd. Tomás Fornés en collega's valideerden het poolen van porties tot 375 g voor Salmonella met vijf methoden (kweek, ELISA en realtime-PCR) in 23 levensmiddelen (onder meer zoetwaren, zuigelingenvoeding, dierenvoeding en drankpoeders). Bij 22 van de 23 was de RLOD50 ten opzichte van 25 g aanvaardbaar (kleiner dan 2,5), op voorwaarde dat de bouillon werd voorverwarmd en de maximale incubatietijd werd gerespecteerd. Poolen komt ook in de regelgeving voor: Verordening (EG) nr. 2073/2005 vraagt de nekhuid van ten minste drie pluimveekarkassen van hetzelfde koppel van herkomst samen te voegen tot een monster van 26 g, en de swabs van verschillende plaatsen op een karkas vóór de analyse te poolen. Hoe n en c in die plannen worden gelezen, staat in attributenbemonsteringsplannen, en waarom de bouillonstap beslissend is, in microbiologische ophoping.
Welke TAAG-kits en -media hiermee verband houden
De kit bepaalt voor welke portie hij gevalideerd is. In de TAAG-catalogus vermeldt Elevia 1.1 Salmonella spp. (V-PAT04, RT-qPCR met AiGOR-technologie) een gevoeligheid van 1 KVE/375 g in levensmiddelen en 1 KVE/monster op oppervlakken; zijn AOAC-certificering omvat porties van 375 g chocolade met 62 % cacao, cacaomassa, mageremelkpoeder en pinda's, en TAAG vermeldt ook gevalideerde matrices zoals gevulde chocolade, rundergehakt (90 % mager), diervoederpellets, gepasteuriseerd vloeibaar ei en roestvrijstalen oppervlakken. Zijn informatieblad noemt het supplement Potentia 1 Salmonella spp. (V-PET06), een groeibevorderaar voor gebufferd peptonwater. Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97, realtime-PCR) vermeldt 1 KVE/25 g, met als gevalideerde matrices rauwe kippendij, diepgevroren rundvleesburger, longaniza-achtige worst, mortadella en oppervlakken, en hoort bij Augmentis 14 Universal Gram negative (V-FL46, flessen van 225 mL, het bouillonvolume voor 25 g bij 1:10). Een kit gebruiken met een portie, een matrix of een poolingschema dat afwijkt van wat is aangegeven, vereist de verificatie of validatie die het amendement op ISO 6887-1 vraagt. Om op matrix te kiezen, zie hoe je een TAAG-kit kiest.
Conclusie
De voorbereiding van het monster bepaalt evenzeer wat een resultaat vertegenwoordigt als de detectiemethode. ISO 6887-1 legt de initiële suspensie 1:10 vast, gecontroleerde verdunningsvloeistoffen, homogeniseren zonder het monster op te warmen en een maximum van 45 minuten tot het enten, en de delen 2 tot 6 passen die regels aan voor vlees, vis, zuivel, droge producten en primaire productie. Porties samenstellen of poolen voor pathogenen is een geldig en door bewijs ondersteund instrument, maar alleen met eenheden uit dezelfde partij, voorverwarmde bouillon, een constante verhouding en een gevalideerde portiegrootte. Deze beslissingen schriftelijk vastleggen in de laboratoriumprocedure is wat het mogelijk maakt resultaten tussen ploegen, analisten en laboratoria te vergelijken.
Over TAAG
Vraag TAAG of Elevia 1.1 Salmonella spp. of Ampliora 1.1 Salmonella spp. gevalideerd zijn voor de analytische portie en het poolingschema dat je laboratorium gebruikt.
Veelgestelde vragen
Waarom wordt de initiële suspensie bereid in 1:10?
Omdat ISO 6887-1 de primaire verdunning definieert als de analytische portie gemengd met normaal negen keer haar hoeveelheid verdunningsvloeistof, wat de basis vormt van een decimale reeks. De norm staat andere verhoudingen toe, zoals 1 op 20 of 1 op 100 voor dikke producten, mits er bij de berekening van het resultaat rekening mee wordt gehouden.
Hoe lang mag een suspensie wachten voordat ze wordt geënt?
Volgens ISO 6887-1 niet meer dan 45 minuten van het einde van de initiële suspensie tot het inoculum het uiteindelijke medium raakt, en niet meer dan 30 minuten tot het begin van de verdunningen. Als het in het laboratorium warmer is dan 27 °C, zouden die tijden korter moeten zijn. Het BAM van de FDA stelt een maximum van 15 minuten van het homogeniseren tot alle verdunningen in hun media zitten.
Wat is het verschil tussen een samengesteld en een gepoold monster?
Bij het samengestelde monster worden verscheidene eenheden gemengd en wordt een portie van de grootte van de methode geanalyseerd, bijvoorbeeld 25 g, en wordt het resultaat uitgedrukt in 25 g. Bij het gepoolde monster wordt het volledige mengsel geanalyseerd, bijvoorbeeld 375 g, en wordt het resultaat uitgedrukt in die totale massa. Beide zijn alleen bedoeld voor kwalitatieve bepalingen en met eenheden uit dezelfde partij.
Kan voor Salmonella 375 g worden geanalyseerd in plaats van 25 g?
Ja, als de methode voor die grotere portie gevalideerd is en de voorwaarden van amendement 1:2024 op ISO 6887-1 worden nageleefd: voorverwarmde bouillon, bekend temperatuurprofiel en dezelfde verhouding monster/verdunningsvloeistof. Als de omvang niet volgens ISO 16140-2 of 16140-5 werd gevalideerd, moet het laboratorium haar valideren met het protocol van bijlage H van het amendement op ISO 16140-4.
Hoe wordt een monster vóór de analyse ontdooid?
ISO 6887-1 staat toe kleine verpakkingen tot 3 uur bij 18-27 °C of tot 24 uur bij 5 ± 3 °C te laten staan, en ontraadt een waterbad of koud stromend water. Het BAM ontdooit liever niet en gebruikt, indien nodig, 2-5 °C in maximaal 18 uur of minder dan 45 °C gedurende niet meer dan 15 minuten met schudden.