Teil der Säule Grundlagen und Standardisierung des TAAG Learning Centers. Ergänzen Sie ihn mit dem Leitfaden zur AOAC-PTM-Zertifizierung und dem zur traditionellen mikrobiologischen Kultur.
Inhaltsverzeichnis
Zwei verschiedene Fragen zu ein und derselben Methode
Bevor ein Labor eine mikrobiologische Methode in der Routine einsetzt, muss es zwei Fragen beantworten. Die erste lautet, ob die Methode funktioniert: ob sie den Zielmikroorganismus mit akzeptabler Leistung im Vergleich zu einer anerkannten Referenz nachweist oder quantifiziert. Die zweite lautet, ob sie in den eigenen Händen funktioniert, mit dem eigenen Personal, den eigenen Geräten und den Lebensmitteln, die täglich untersucht werden. Die erste Frage beantwortet die Validierung, die zweite die Verifizierung.
Die Unterscheidung ist keine Spitzfindigkeit. Die Norm ISO/IEC 17025:2017, die die Kompetenz von Prüflaboratorien regelt, verlangt, dass das Labor vor der Einführung einer Methode verifiziert, dass es sie korrekt anwenden kann, indem es nachweist, dass es die geforderte Leistung erreicht, und die Aufzeichnungen aufbewahrt. Eine validierte Methode, die im anwendenden Labor niemand verifiziert hat, hinterlässt eine Lücke, die häufig bei Audits auffällt. Die Akkreditierungsanforderungen werden im Artikel zu ISO/IEC 17025 in Lebensmittellaboren behandelt.
Validierung: die Leistung der Methode festlegen
Die Validierung besteht darin, die Leistungsmerkmale einer Methode zu bestimmen und objektive Nachweise zu erbringen, dass sie die Anforderungen für eine vorgesehene Verwendung erfüllt. In der Lebensmittelmikrobiologie bedeutet das fast immer, eine alternative Methode (zum Beispiel einen PCR-Kit oder ein chromogenes Medium) mit einer Referenzmethode zu vergleichen, meist einem normierten traditionellen Kulturprotokoll wie ISO 6579-1 für Salmonella.
Die Normenreihe ISO 16140
Das technische Komitee ISO/TC 34/SC 9 ersetzte die alte ISO 16140:2003 durch eine Normenreihe, von denen jede für ein anderes Szenario gedacht ist:
- ISO 16140-1:2016: gemeinsames Vokabular der Validierung.
- ISO 16140-2:2016: Protokoll zur Validierung alternativer, meist kommerzieller Methoden gegen eine Referenzmethode. Es gibt eine 2024 veröffentlichte Änderung, die einen Teil der Berechnungen überarbeitete.
- ISO 16140-3:2021: Protokoll zur Verifizierung bereits validierter Referenzmethoden und alternativer Methoden in einem einzelnen Labor.
- ISO 16140-4: Validierung in einem einzelnen Labor. Ihre Ergebnisse gelten nur für das Labor, das die Studie durchgeführt hat.
- ISO 16140-5: faktorielle Ringversuchsvalidierung für nicht kommerzielle Methoden, mit weniger teilnehmenden Laboren als in Teil 2.
- ISO 16140-6:2019: Validierung alternativer Bestätigungs- und Typisierungsmethoden, die von einer verdächtigen Kolonie ausgehen und nicht von einer Lebensmittelprobe.
Die Reihe wird durch ISO 17468 ergänzt, die die technischen Anforderungen für die Erstellung oder Überarbeitung einer normierten Referenzmethode festlegt.
Was eine Validierung nach ISO 16140-2 umfasst
Das Protokoll hat zwei Phasen. Die erste ist eine Vergleichsstudie, die in einem organisierenden Labor durchgeführt wird: Kontaminierte Proben werden mit beiden Methoden untersucht, um die Sensitivität zu messen, der relative Nachweisgrenzwert (RLOD) wird bestimmt, und die Inklusivität und Exklusivität werden mit 50 Stämmen des Zielmikroorganismus und 30 Nicht-Zielstämmen geprüft. Bei quantitativen Methoden bewertet die Vergleichsstudie die relative Richtigkeit und das Genauigkeitsprofil. Die zweite Phase ist eine Ringversuchsstudie, in der mehrere Labore dieselben Proben untersuchen, um die Reproduzierbarkeit der Methode abzuschätzen.
Der Geltungsbereich der Validierung hängt von den untersuchten Lebensmittelkategorien ab. Um eine Methode für ein „breites Spektrum von Lebensmitteln“ als valide zu erklären, müssen mindestens fünf Kategorien abgedeckt sein. Diese Angabe zum Geltungsbereich sollte man bei einem Zertifikat als Erstes prüfen.
Wer zertifiziert
In Europa stellen unabhängige Stellen wie MicroVal, NF Validation (AFNOR) und NordVal (NMKL) Zertifikate auf Grundlage von ISO 16140-2 aus und veröffentlichen die Berichte auf ihren Websites. In den Vereinigten Staaten ist das am weitesten verbreitete System das von AOAC International, das wir im Leitfaden zur AOAC-PTM-Zertifizierung erläutern.
Was die europäische Regulierung sagt
Die Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 legt in Artikel 5 fest, dass die Analysemethoden des Anhangs I die Referenzmethoden sind und dass die Verwendung alternativer Methoden zulässig ist, wenn sie gegen diese Referenz validiert und, sofern kommerziell, von einer dritten Stelle nach dem Protokoll der EN ISO 16140 oder anderen ähnlichen, international anerkannten Protokollen zertifiziert sind. Die Verordnung (EU) 2019/229 ergänzte wesentliche Definitionen: was unter einem „breiten Spektrum von Lebensmitteln“ zu verstehen ist und was eine vom Hersteller der Methode unabhängige Zertifizierungsstelle ist.
Verifizierung: nachweisen, dass die Methode in Ihrem Labor funktioniert
ISO 16140-3 definiert die Verifizierung als den Nachweis, dass eine validierte Methode in der Hand des Anwenders gemäß den Spezifikationen ihrer Validierung funktioniert. Sie unterteilt den Prozess in zwei Stufen.
Stufe 1: Verifizierung der Implementierung
Das Labor weist nach, dass es die Methode ausführen kann, indem es ein einziges Lebensmittel verwendet, ausgewählt unter denen, die in der Validierungsstudie untersucht wurden. Ähneln die Ergebnisse denen der Validierung, ist das grundlegende Problem (die Technik) gelöst.
Stufe 2: Verifizierung der Lebensmittel des Labors
Anschließend weist das Labor nach, dass die Methode mit den Lebensmitteln funktioniert, die es zu untersuchen angibt. Dafür wählt es aus jeder in seinem Geltungsbereich enthaltenen Kategorie ein „schwieriges“ Lebensmittel aus: Produkte mit niedriger Wasseraktivität, mit natürlichen antimikrobiellen Stoffen wie Gewürzen, mit Lecithin oder mit hohem Fettgehalt. Der Schulungsleitfaden des ISO-Komitees selbst zeigt Beispiele wie Speiseeis, Eipulver, gewürztes Fleisch und Kakaopulver.
Was gemessen wird und nach welchem Akzeptanzkriterium
Qualitative Methoden: eLOD50
Bei Nachweismethoden wird der Nachweisgrenzwert bei 50 % (eLOD50) geschätzt: die Kontamination, bei der die Methode in der Hälfte der untersuchten Portionen positiv ausfällt. Er heißt „geschätzt“, weil die Probenzahl viel geringer ist als bei einer vollständigen Validierung. Das Akzeptanzkriterium lautet, dass der erhaltene eLOD50 das Vierfache des LOD50 der Validierung nicht überschreitet. Im Beispiel des ISO-Schulungsleitfadens für Salmonella nach ISO 6579-1 lag der Referenz-LOD50 bei 5,7 KBE, die Grenze bei 22,8 KBE, und das Labor erzielte 3,0 KBE und erfüllte damit das Kriterium. Das Konzept des LOD50 wird im Artikel zu Nachweisgrenze und Messunsicherheit behandelt.
Quantitative Methoden: Reproduzierbarkeit und Bias
Bei Zählungen misst die Verifizierung der Implementierung die Standardabweichung der Reproduzierbarkeit innerhalb des Labors (SIR), mit einem an ISO 19036 ausgerichteten Design. Das Kriterium lautet, dass sie das Doppelte des niedrigsten mittleren Reproduzierbarkeitswerts der Validierung nicht überschreitet. Die Verifizierung der Lebensmittel misst den geschätzten Bias (eBias): Portionen werden auf drei Stufen in doppelter Ausführung kontaminiert, und die Differenz zum erwarteten Wert darf auf keiner Stufe 0,5 log10 überschreiten.
Bestätigungs- und Typisierungsmethoden
Hier wird nur die Verifizierung der Implementierung verlangt: Es werden Ziel- und Nicht-Zielstämme getestet (im Beispiel des Leitfadens je fünf) und eine 100-prozentige Übereinstimmung mit dem erwarteten Ergebnis gefordert.
Die Frist 2028 für nicht validierte Referenzmethoden
Viele ISO-Referenznormen wurden ohne Leistungsdaten veröffentlicht. Für sie bietet ISO 16140-3 in Anhang F ein Übergangsprotokoll. Laut dem Übergangsdokument des ISO-Komitees kann dieser Anhang bis zum 31. Dezember 2027 verwendet werden; ab dem 1. Januar 2028 können nur noch validierte Referenzmethoden gemäß ISO 16140-3 verifiziert werden. ISO-Normen sind freiwillig, aber die Akkreditierungsstellen legen sie meist als Kriterium zugrunde.
Dasselbe Dokument stellt klar, wann erneut verifiziert werden muss. Eine bereits akkreditierte Methode braucht keine neue Verifizierung, solange sie sich nicht ändert. Eine neue Methode oder eine neue Lebensmittelkategorie innerhalb des Geltungsbereichs braucht sie dagegen. Auch wenn eine validierte Methode eine wesentliche technische Änderung mit relevanter Auswirkung erfährt, ist sie erforderlich.
Wenn die Verifizierung nicht bestanden wird
Die Norm verlangt vor einer Wiederholung eine Ursachenanalyse. Häufige Ursachen sind die Herstellung und der Gehalt des Inokulums, die Homogenisierung der Probe, die Kalibrierung der Geräte, Chargen von Medien oder Reagenzien und die Anwendung des Protokolls durch den Analytiker. Besteht das Problem fort, ist der nächste Schritt, den Anbieter der Methode (sofern kommerziell), die Normungsorganisation (sofern Referenzmethode) oder die Zertifizierungsstelle zu konsultieren.
Häufige Fehler
- Davon auszugehen, dass ein Validierungszertifikat die Verifizierung im Labor ersetzt.
- Die Methode auf Lebensmittel einer Kategorie anzuwenden, die nicht im Geltungsbereich ihrer Validierung liegt.
- Nur mit einem „einfachen“ Lebensmittel zu verifizieren und nicht mit einem, das für die tatsächlichen Schwierigkeiten des Labors repräsentativ ist.
- Die Verifizierungsaufzeichnungen nicht aufzubewahren, die nach ISO/IEC 17025 verlangt werden.
- Einen Schritt des Protokolls zu ändern, etwa die Dauer der Anreicherung, und die Methode weiterhin als validiert zu behandeln.
Fazit
Validieren und Verifizieren beantworten unterschiedliche Fragen: ob eine Methode funktioniert und ob sie in Ihrem Labor funktioniert. Die Normenreihe ISO 16140 ordnet beide Prozesse, von der Validierung alternativer Methoden nach ISO 16140-2 bis zur Verifizierung in einem einzelnen Labor nach ISO 16140-3, mit konkreten Akzeptanzkriterien wie dem eLOD50 oder dem eBias. Den Geltungsbereich des Zertifikats zu prüfen, mit repräsentativen Lebensmitteln zu verifizieren und die Aufzeichnungen aufzubewahren, verhindert, dass eine gut validierte Methode zum Schwachpunkt des Labors wird.
Über TAAG
Erfahren Sie, wie TAAG den validierten Geltungsbereich seiner molekularen Nachweis-Kits dokumentiert, um deren Verifizierung im Labor jedes Kunden zu erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Worin besteht der Unterschied zwischen der Validierung und der Verifizierung einer mikrobiologischen Methode?
Die Validierung legt die Leistung der Methode fest und zeigt, dass sie für eine vorgesehene Verwendung taugt, normalerweise im Vergleich mit einer Referenzmethode. Die Verifizierung zeigt, dass ein konkretes Labor diese Leistung erreicht, wenn es sie mit eigenen Geräten, eigenem Personal und eigenen Lebensmitteln anwendet.
Muss eine Methode mit MicroVal-, NF-Validation- oder AOAC-Zertifikat verifiziert werden?
Ja. Das Zertifikat stützt die Methode, aber ISO/IEC 17025 verlangt, dass jedes Labor vor der Anwendung verifiziert, dass es sie korrekt anwenden kann, und ISO 16140-3 beschreibt, wie das geschieht.
Was ist der eLOD50?
Es ist der bei der Verifizierung einer qualitativen Methode geschätzte Nachweisgrenzwert bei 50 %: die Kontamination, bei der die Methode den Mikroorganismus in der Hälfte der untersuchten Portionen nachweist. ISO 16140-3 akzeptiert das Ergebnis, wenn es das Vierfache des in der Validierung erhaltenen LOD50 nicht überschreitet.
Was gilt für ISO-Referenzmethoden ohne Validierungsdaten?
Bis zum 31. Dezember 2027 können sie mit dem Übergangsprotokoll in Anhang F der ISO 16140-3 verifiziert werden. Ab dem 1. Januar 2028 können nur noch validierte Referenzmethoden nach dieser Norm verifiziert werden.