Teil des Themenschwerpunkts Labormethoden des TAAG Learning Centers, zusammen mit der mikrobiologischen Anreicherung.
Inhaltsverzeichnis
Ein Positivbefund ist nicht immer ein Endergebnis
In einem Laborbericht kann "positiv" zwei verschiedene Dinge bedeuten. Es kann ein präsumtives Ergebnis sein: Der Test lieferte ein mit dem gesuchten Mikroorganismus vereinbares Signal, aber seine Identität wurde noch nicht nachgewiesen. Oder es kann ein bestätigtes Ergebnis sein: Der Mikroorganismus wurde isoliert und mit zusätzlichen Tests belegt, dass er tatsächlich das Ziel der Analyse ist. Beides zu verwechseln führt zu übereilten Entscheidungen in die eine oder andere Richtung: Produkt freizugeben, das hätte zurückgehalten werden müssen, oder eine Charge wegen eines Ergebnisses zu vernichten, das nicht haltbar war.
Dieser Artikel geht diesen Abschnitt der Analyse durch, vom Screening bis zur Bestätigung, mit dem Bacteriological Analytical Manual (BAM) der FDA für Salmonella und der Normenreihe ISO 16140 als Referenz, die festlegt, wie alternative Methoden gegenüber Referenzmethoden validiert werden.
Woher ein präsumtives Ergebnis kommt
In der traditionellen Kultur
In der traditionellen mikrobiologischen Kultur ist eine Kolonie mit typischer Morphologie auf einem Selektivmedium ein präsumtiver Befund. Kapitel 5 des BAM beschreibt die Abfolge für Salmonella: Vorbereitung und Voranreicherung am ersten Tag, selektive Anreicherung am zweiten, Ausstrich auf Selektivplatten am dritten, biochemisches Screening am vierten und Bestätigung am fünften. Das Handbuch selbst gibt an, dass die Kulturmethode 4 bis 5 Tage braucht, um zu einem präsumtiven Ergebnis zu gelangen.
In molekularen Screening-Methoden
Die PCR und andere Schnellmethoden werden häufig als Screening eingesetzt. Die BAM-Ausgabe vom Januar 2026 enthält einen im Mai 2024 hinzugefügten Abschnitt mit von der FDA entwickelten qPCR- und LAMP-Methoden, die auf die 24-stündige Voranreicherungskultur angewendet werden, also am zweiten Tag. Die vom Handbuch festgelegte Regel ist klar: Proben mit negativem Screening werden als negativ berichtet und erfordern keine weitere Kulturanalyse; Proben mit positivem Screening müssen durch Kultur nach den Verfahren zur Isolierung und Identifizierung bestätigt werden.
Diese Asymmetrie erklärt den Wert des Screenings. Die meisten Routineproben sind negativ, und für sie liegt das Ergebnis Tage früher vor. Nur die positiven durchlaufen den langen Weg.
Was ISO 16140-2 zur Bestätigung sagt
ISO 16140-2:2016 ist das Protokoll zur Validierung alternativer (im Allgemeinen kommerzieller) Methoden gegenüber einer Referenzmethode. Die Norm geht von einem für die tägliche Arbeit nützlichen Gedanken aus: Viele alternative Methoden haben zwei Schritte, zuerst die Anreicherung und den Nachweis, danach die Bestätigung dieses Ergebnisses. Das Endergebnis der Methode ist das, das aus dem zweiten Schritt hervorgeht.
Während der Validierung verlangt die Norm, die positiven Ergebnisse der alternativen Methode, die nicht mit der Referenzmethode übereinstimmen, zu bestätigen, denn diese Bestätigung erlaubt es zu wissen, ob es sich um ein richtig oder ein falsch positives Ergebnis handelt. Die Bestätigung muss in der Lage sein, das Isolat wiederzugewinnen und seine Identität nachzuweisen, und kann auf dem Verfahren der Referenzmethode, auf dem Bestätigungsschritt der alternativen Methode selbst, auf einer Kombination beider oder auf jedem anderen Mittel beruhen, das den Mikroorganismus isoliert und identifiziert.
Es gibt ein technisches Detail mit praktischen Folgen. Unterscheidet sich die Anreicherung der alternativen Methode von der der Referenz (weniger Schritte oder weniger Stunden Bebrütung), verlangt die Norm einen zweiten Bestätigungsweg: einen Teil der Anreicherung der alternativen Methode in das Schema der Referenzmethode zu überführen und dabei mindestens deren gesamte Bebrütungszeit einzuhalten. Mit anderen Worten: Eine kurze Anreicherung kann genügen, um ein molekulares Signal nachzuweisen, aber nicht unbedingt, um eine Kolonie auf der Platte wiederzugewinnen.
Diese Norm hat regulatorisches Gewicht. In der Europäischen Union änderte die Verordnung (EU) 2019/229 Artikel 5 der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005, um zu verlangen, dass alternative Methoden gegenüber der Referenzmethode in Anhang I gemäß EN ISO 16140-2 validiert sind und dass registrierte Methoden von einer unabhängigen Stelle zertifiziert sind. In der Praxis umfassen die Validierung und die AOAC-PTM-Zertifizierung oder die ISO-16140-Zertifizierung einer Methode ihr Bestätigungsprotokoll.
Wie heute bestätigt wird
Biochemie und Serologie
Der klassische Weg kombiniert biochemische Tests, die bewerten, welche Substrate das Isolat verstoffwechselt, mit der Serologie, die Oberflächenantigene identifiziert. Für Salmonella verlangt das BAM, dass die serologische Bestätigung mit den somatischen (O) und Geißelantigenen (H) stets von einer biochemischen Bestätigung begleitet wird. Es erlaubt, die konventionelle Röhrchenbatterie durch Systeme wie API 20E, Enterotube II oder Vitek 2 GN zu ersetzen, warnt aber, dass kommerzielle biochemische Kits die Serologie nicht ersetzen.
Instrumentelle und molekulare Methoden am Isolat
Das BAM akzeptiert zur Bestätigung präsumtiver Isolate auch eine von der FDA entwickelte qPCR und ein LAMP, eine isotherme Amplifikationsmethode (AOAC OMA 2013.14) und die Identifizierung mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie (AOAC OMA 2017.09), dazu weitere nach den FDA-Leitlinien, dem AOAC-Anhang J oder ISO 16140-6:2019 validierte Methoden. Ein Isolat wird als Salmonella berichtet, wenn Serologie und Biochemie gemeinsam oder eine der akzeptierten instrumentellen Methoden es bestätigen. Widersprechen sich die Bestätigungen, wird auf zusätzliche Tests oder ein Referenzlabor für die endgültige Typisierung zurückgegriffen.
ISO 16140-6: die Bestätigungsmethode selbst validieren
ISO 16140-6:2019 deckt die Validierung alternativer Bestätigungs- und Typisierungsmethoden ab. Sie vergleicht die alternative Methode mit dem Bestätigungsverfahren der Referenzmethode oder, wenn nötig, mit einer Referenz-Bestätigungsmethode wie der Ganzgenomsequenzierung (WGS). Sie gilt auch für die Typisierung, zum Beispiel die Serotypisierung von Salmonella oder die molekulare Typisierung von STEC.
Warum ein präsumtives Ergebnis möglicherweise nicht bestätigt wird
Ein Screening-Positivbefund, der nicht bestätigt wird, bedeutet nicht automatisch, dass sich der Test "geirrt" hat. Es gibt mehrere mögliche Ursachen, die man unterscheiden sollte:
- Erbmaterial ohne lebensfähige Zelle: Eine DNA-basierte Methode kann Reste von Zellen nachweisen, die durch eine Hitzebehandlung oder ein Desinfektionsmittel inaktiviert wurden, eine Grenze, die wir unter RNA vs. DNA erklären. In diesem Fall gibt es nichts Lebendes zu isolieren.
- Kreuzreaktivität: ein Nicht-Zielorganismus, der einen Teil der gesuchten Sequenz teilt. Das ist es, was die Exklusivitätsstudie bei der Validierung der Methode bewertet.
- Schwierigkeit, das Isolat wiederzugewinnen: Gestresste Zellen, eine begleitende Mikrobiota, die in der Anreicherung konkurriert, oder sehr niedrige Werte können verhindern, dass die Kolonie erhalten wird, obwohl der Krankheitserreger vorhanden war. Deshalb sieht ISO 16140-2 den zweiten Bestätigungsweg vor, wenn sich die Anreicherungen unterscheiden.
- Kontamination im Labor: eine Verschleppung von amplifiziertem Material oder einer Positivkontrolle. Die Kontrollen jedes Laufs, die wir unter Kontrollen einer PCR behandeln, dienen dazu, sie zu erkennen.
Was zu tun ist, bis die Bestätigung vorliegt
Die Bestätigung ist ein analytischer Schritt, aber die Entscheidung über das Produkt trifft der Betrieb. Einige vernünftige Kriterien:
- Fertigprodukt: Eine Charge mit präsumtiv positivem Ergebnis wird bis zur Bestätigung zurückgehalten. Eine Charge freizugeben, "weil es noch nicht bestätigt ist", kehrt die Logik des Screenings um.
- Umgebung: In einem Umgebungsmonitoring-Programm behandeln viele Betriebe das Präsumtive als Signal, sofort zu handeln (verstärkte Reinigung, Beprobung von Vektoren um den positiven Punkt), ohne die Bestätigung abzuwarten, weil die Kosten einer verspäteten Reaktion höher sind.
- Rückverfolgbarkeit des Isolats: Wird das Ergebnis bestätigt, erlaubt die Aufbewahrung des Isolats, es später zu typisieren und mit früheren Funden desselben Betriebs zu vergleichen.
Nicht ratsam ist, ein Präsumtives als endgültig zu berichten oder ein nicht bestätigtes Präsumtives zu verwerfen, ohne zu verstehen, warum es nicht bestätigt wurde. Beides sind Laborentscheidungen, die im Verfahren festgeschrieben sein müssen, bevor der erste Positivbefund eintrifft.
Fazit
Ein präsumtives Ergebnis ist ein Signal, das die Identität des Mikroorganismus noch nicht nachgewiesen hat, und ein bestätigtes ist ein mit zusätzlichen Tests identifiziertes Isolat. Das BAM der FDA verlangt, positive Screening-Ergebnisse durch Kultur zu bestätigen, ISO 16140-2 integriert die Bestätigung in die Validierung alternativer Methoden, und ISO 16140-6 erlaubt es, schnellere Methoden für diesen Schritt zu validieren. Zwischen beiden Zeitpunkten entscheidet der Betrieb: das Produkt zurückhalten, auf die Umgebung einwirken und schriftlich festhalten, was geschieht, wenn ein Präsumtives nicht bestätigt wird.
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Häufig gestellte Fragen
Ist ein positives PCR-Ergebnis ein endgültiges Ergebnis?
In den meisten Schemata nein. Das BAM der FDA legt fest, dass Proben mit positivem qPCR- oder LAMP-Screening durch Kultur bestätigt werden müssen, während die negativen ohne weitere Analyse als negativ berichtet werden.
Wie lange dauert die Bestätigung von Salmonella durch Kultur?
Das BAM beschreibt einen Ablauf von fünf Tagen: Voranreicherung, selektive Anreicherung, Ausstrich auf Platten, biochemisches Screening und Bestätigung. Das Handbuch selbst gibt an, dass die Kulturmethode 4 bis 5 Tage braucht, um zu einem präsumtiven Ergebnis zu gelangen.
Kann man statt mit Serologie auch mit MALDI-TOF oder PCR bestätigen?
Ja, am Isolat. Das BAM akzeptiert unter anderem eine qPCR und ein LAMP der FDA sowie die Identifizierung mittels MALDI-TOF (AOAC OMA 2017.09). ISO 16140-6:2019 legt fest, wie diese alternativen Bestätigungsmethoden validiert werden.
Was bedeutet es, wenn ein präsumtives Ergebnis nicht bestätigt wird?
Es kann sich um ein falsch positives Ergebnis handeln, aber auch um DNA nicht lebensfähiger Zellen, um ein schwer wiederzugewinnendes Isolat oder um eine Kontamination im Labor. Deshalb sollte die Ursache untersucht werden, bevor das Ergebnis verworfen wird.