Vor diesem Artikel lohnt sich ein Blick auf wie die PCR in der Mikrobiologie funktioniert.
Was ist PCR multiplex?
Die traditionelle (oder „simplex“) PCR amplifiziert und weist pro Reaktion ein einziges genetisches Ziel nach: ein Röhrchen, ein Mikroorganismus. Die PCR multiplex kombiniert mehrere Primer- und Sondensätze — jeder mit einem eigenen Fluorophor markiert — in derselben Reaktion und erlaubt so, mehrere Mikroorganismen oder Gene in einem einzigen Röhrchen und einem einzigen Lauf zu identifizieren.
Wie unterscheidet sie ein Ziel vom anderen?
Jede Sonde emittiert Fluoreszenz in einem eigenen Farbkanal (FAM, HEX, ROX, Cy5, unter anderem), sodass das PCR-Gerät mehrere Signale gleichzeitig lesen kann und die Software jedes davon dem entsprechenden Mikroorganismus zuordnet. Die praktische Grenze ist nicht die Anzahl der gesuchten Mikroorganismen, sondern wie viele unterschiedliche Fluoreszenzkanäle das Gerät lesen kann und wie viele Primer in derselben Reaktion koexistieren können, ohne sich gegenseitig zu stören.
Vorteile gegenüber mehreren einfachen PCR-Läufen
Weniger Zeit und weniger Probe
Statt eine Probe auf mehrere Röhrchen zu verteilen, um Salmonella, Listeria und E. coli getrennt zu suchen, liefert ein einziger multiplex-Test alle drei Ergebnisse gleichzeitig und reduziert so das benötigte Probenvolumen, die Reagenzien und die Analystenzeit.
Weniger Variabilität zwischen Ergebnissen
Da dieselben Ziele in derselben Reaktion und unter denselben Bedingungen analysiert werden, verringert sich das Risiko der Variabilität, die beim Vergleich von Ergebnissen aus getrennten Röhrchen und Läufen besteht.
Grenzen und Designüberlegungen
Einen zuverlässigen multiplex-Test zu gestalten ist komplexer als einen einfachen: Primer eines Ziels können mit denen eines anderen interferieren (Primer-Dimere), und zu viele Ziele hinzuzufügen kann die Sensitivität jedes Einzelnen reduzieren. Deshalb ist die Gestaltung eines multiplex-Panels — was in welchem Verhältnis kombiniert wird — selbst eine spezialisierte Optimierungsarbeit, die zunehmend durch computergestützte Designwerkzeuge unterstützt wird.
Wo wird sie in der Lebensmittelindustrie eingesetzt?
Sie ist besonders wertvoll in kombinierten Krankheitserreger-Panels (zum Beispiel Salmonella + Listeria + E. coli O157:H7 + S. aureus in einem einzigen Test) und in Verderbnis-Panels, die gleichzeitig acidophile Bakterien, Hefen und Schimmelpilze in Getränken suchen.
Fazit
Die PCR multiplex löst ein sehr konkretes Problem der industriellen Mikrobiologie: wie viele Mikroorganismen gesucht werden müssen und wie viel Zeit und Probe dafür nötig sind. Mehrere Ziele in einer einzigen Reaktion zu kombinieren beschleunigt die Entscheidung zur Produktfreigabe, solange das Panel gut konzipiert ist.
Über TAAG
Erfahren Sie, wie die multiplex-Panels von TAAG Krankheitserreger und Verderbniserreger in einem einzigen molekularen Arbeitsablauf kombinieren.
Häufig gestellte Fragen
Ist ein multiplex-Test weniger sensitiv als ein einfacher?
Das kann der Fall sein, wenn das Design nicht gut optimiert ist, da die verschiedenen Primer um dieselben Reagenzien konkurrieren; ein gutes multiplex-Design minimiert diesen Sensitivitätsverlust.
Wie viele Mikroorganismen kann ein einziges multiplex-Panel nachweisen?
Das hängt vom Gerät und Design ab; typische Industriepanel kombinieren zwischen 2 und 5 Ziele pro Reaktion, wobei Schmelzkurventechnologien Dutzende in einem einzigen Röhrchen identifizieren können.
Ersetzt PCR multiplex die traditionellen Kulturpanels?
In vielen Arbeitsabläufen ja, für schnelles Screening; das traditionelle Kulturverfahren bleibt meist als Bestätigung bestehen, wenn das regulatorische Umfeld dies verlangt.