Teil der Säule Grundlagen und Standardisierung des TAAG Learning Centers. Vertieft, was wir zu der Interpretation von KBE und zur Stufe der mikrobiologischen Anreicherung gesehen haben.
Inhaltsverzeichnis
Ein mikrobiologisches Ergebnis hat immer eine Spanne
Ein Bericht lautet „Salmonella: in 25 g nicht nachgewiesen“ oder „aerobe mesophile Keime: 1,2 × 105 KBE/g“. Beide Ergebnisse wirken endgültig, doch keines ist es ganz. Das erste hängt von der Wahrscheinlichkeit ab, dass die Methode die wenigen Zellen erfasst, die in der analysierten Portion vorhanden sein könnten. Das zweite ist eine Schätzung mit einer Streuung, die in der Mikrobiologie deutlich größer ist als bei einer chemischen Analyse. Diese Spannen zu verstehen, ermöglicht gute Entscheidungen, wenn ein Ergebnis nahe an einem Grenzwert liegt.
Warum die Mikrobiologie anders ist
Bakterien verteilen sich in einem Lebensmittel nicht wie ein gelöster Stoff. Sie sind diskrete Partikel, oft in Gruppen, und bei niedriger Konzentration ist ihr Vorkommen in einer Prüfportion Zufall. Enthält eine Charge im Mittel eine Salmonella-Zelle pro 25 g, haben manche 25-g-Portionen keine, andere eine und wieder andere zwei oder mehr. Diese zufällige Verteilung folgt einer Poisson-Verteilung und setzt eine theoretische Grenze, die keine Methode überschreiten kann.
Die theoretische Obergrenze jeder Methode
Bei einer Poisson-Verteilung beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass eine Portion mindestens eine Zelle enthält, 1 − e−λ, wobei λ die mittlere Zellzahl pro Portion ist. Bei einem Mittel von 1 KBE pro Portion liegt diese Wahrscheinlichkeit bei etwa 63 %: Selbst eine perfekte Methode würde in mehr als einem Drittel der Fälle versagen, einfach weil die Zelle nicht in der Portion ist. Für eine Nachweisrate von 50 % genügt ein Mittel von ln 2, rund 0,69 KBE pro Portion; für 95 % werden etwa 3 KBE pro Portion benötigt.
Qualitative Methoden: vom LOD zum LOD50
Bei einer Nachweismethode (Anwesenheit oder Abwesenheit) wird die Nachweisgrenze nicht als fester Zahlenwert angegeben, sondern als Kurve der Nachweiswahrscheinlichkeit (POD) in Abhängigkeit von der Kontamination. Wilrich und Wilrich beschrieben 2009 im Journal of AOAC International ein statistisches Modell zur Schätzung dieser Kurve und des LODp, der Kontamination, die die Methode mit einer Wahrscheinlichkeit p nachweist. Am häufigsten wird der LOD50 verwendet: die Konzentration, bei der die Methode in der Hälfte der analysierten Portionen positiv ausfällt.
Der LOD50 ermöglicht es, Methoden untereinander und mit der theoretischen Obergrenze zu vergleichen. ISO 16140-2 nutzt ihn zur Berechnung des relativen Nachweisniveaus (RLOD) zwischen einer alternativen Methode und der Referenzmethode, und ISO 16140-3 verlangt von jedem Labor, bei der Verifizierung einer Methode seinen eigenen eLOD50 zu schätzen und zu prüfen, dass er das Vierfache desjenigen der Validierung nicht übersteigt. Das Verfahren wird im Artikel zur Validierung und Verifizierung von Methoden erklärt.
Was „Abwesenheit in 25 g“ bedeutet
Ein negatives Ergebnis bedeutet, dass die Methode den Mikroorganismus in dieser Portion nicht nachgewiesen hat, nicht dass die Charge frei davon ist. Deshalb werden Abwesenheitskriterien auf mehrere Probeneinheiten angewendet, und deshalb ist die Stufe der Anreicherung so wichtig: Sie ermöglicht es einer einzelnen, oft geschädigten Zelle, sich bis auf nachweisbare Niveaus zu vermehren. Wie viele Einheiten zu analysieren sind und welche Wahrscheinlichkeit, eine kontaminierte Charge zu erkennen, jeder Plan bietet, wird im Artikel zu attributiven Probenahmeplänen behandelt.
Quantitative Methoden: die Bestimmungsgrenze
Bei einer Plattenzählung wird die untere Grenze durch die kleinste ausgesäte Verdünnung festgelegt. Wird 1 mL der Verdünnung 10−1 ausgesät und wächst keine Kolonie, lautet das Ergebnis nicht „0 KBE/g“, sondern „weniger als 10 KBE/g“ (im Beispiel des ISO-19036-Leitfadens, mit zwei Verdünnungen ohne Kolonien, beträgt die berechnete Grenze 9,1 KBE/g). „0“ zu melden ist einer der Interpretationsfehler, die wir bereits im Artikel zu KBE besprochen haben.
Messunsicherheit bei Zählungen: ISO 19036:2019
ISO/IEC 17025 verlangt von akkreditierten Laboren, die Messunsicherheit ihrer Prüfungen zu bewerten. Für Zählungen in der Lebensmittelmikrobiologie ist ISO 19036:2019 die Referenz, veröffentlicht im Oktober 2019 als Überarbeitung der technischen Spezifikation von 2006. Die Präsentation der ISO-Arbeitsgruppe erinnert daran, dass quantitative Ergebnisse in der Mikrobiologie sehr variabel sind, in der Größenordnung von 0,1 bis 1 log10.
Die drei Komponenten
- Technische Unsicherheit: die Variabilität der Analyseschritte (Einwaage, Verdünnungen, Aussaat, Inkubation, Zählung, Bestätigung, Mediumchargen, Analytiker). Sie wird vorzugsweise als Standardabweichung der Laborvergleichspräzision innerhalb eines Labors (sIR) geschätzt, indem mindestens 10 Proben mit je zwei Ergebnissen unter Bedingungen analysiert werden, die so stark variieren wie in der Routine. Sie ist meist die größte Komponente.
- Matrixunsicherheit: inwieweit die Prüfportion die Laborprobe nicht repräsentiert. Für Flüssigkeiten oder gut homogenisierte Proben kann ein fester Wert von 0,1 log10 verwendet werden; bei festen oder mehrkomponentigen Lebensmitteln kann sie deutlich größer sein.
- Verteilungsunsicherheit: die zufällige Poisson-Variation. Sie wird aus der Gesamtzahl der gezählten Kolonien berechnet (0,4343/√ΣC in log10) und fällt vor allem dann ins Gewicht, wenn nur wenige Kolonien gezählt werden.
Erweiterte Unsicherheit und wie sie angegeben wird
Die Komponenten werden als Quadratwurzel aus der Summe ihrer Quadrate kombiniert, und das Ergebnis wird mit einem Erweiterungsfaktor k = 2 multipliziert, was ungefähr einem Vertrauensniveau von 95 % entspricht. Die Norm lässt auch eine vereinfachte Option zu, nur die Vergleichspräzision zu verwenden, und weist darauf hin, dass sie die Unsicherheit bei festen Lebensmitteln oder niedrigen Niveaus unterschätzen kann.
Das Beispiel des ISO-Leitfadens zeigt es gut: Eine Zählung von 1,00 × 105 KBE/g mit einer erweiterten Unsicherheit von 0,31 log10 wird als 5,00 ± 0,31 log10 KBE/g angegeben. In natürlichen Werten reicht das Intervall von 4,90 × 104 bis 2,04 × 105 KBE/g: mehr als das Doppelte zwischen den beiden Enden.
Was die Messunsicherheit nicht umfasst
ISO 19036 lässt zwei Fehlerquellen außen vor. Die erste ist die Probenahmeunsicherheit, der Fehler bei der Entnahme der Laborprobe aus der Charge, der groß sein kann, aber nicht dem Labor zugeschrieben wird. Die zweite ist die systematische Abweichung: In der Lebensmittelmikrobiologie gibt es keinen „wahren“ Wert unabhängig von der Methode, mit dem sich ein Routineergebnis vergleichen ließe.
Von der Zahl zur Entscheidung
Stellen Sie sich eine Zählung von 1,2 × 102 KBE/g gegenüber einem Grenzwert von 100 KBE/g vor. Bei einer typischen erweiterten Unsicherheit von mehreren Zehntel log könnte der wahre Wert unter dem Grenzwert liegen. Erfüllt das Produkt die Anforderung oder nicht? Die Antwort hängt von der Entscheidungsregel ab. ISO/IEC 17025 verlangt, dass das Labor, wenn es Konformität erklärt, die verwendete Regel und das Risiko einer fälschlichen Annahme oder Ablehnung dokumentiert. Ein gängiges Kriterium wertet ein Ergebnis nur dann als nicht konform, wenn es den Grenzwert um mehr als die erweiterte Unsicherheit überschreitet; ein konservativeres wertet nur das als konform, was unter dem Grenzwert abzüglich dieser Unsicherheit liegt. Die Wahl zwischen beiden ist eine Entscheidung des Risikomanagements, kein Detail des Labors.
Häufige Fehler
- „Nicht nachgewiesen“ als Garantie für die Abwesenheit in der gesamten Charge zu lesen.
- Methoden nur nach ihrer Antwortzeit zu vergleichen, ohne ihren LOD50 in der relevanten Matrix zu prüfen.
- „0 KBE/g“ statt „< Bestimmungsgrenze“ anzugeben.
- Unterschiede von 0,2 oder 0,3 log zwischen zwei Zählungen als echte Veränderung des Prozesses zu behandeln.
- Eine Konformitätsaussage zu verlangen, ohne vorher die Entscheidungsregel zu vereinbaren.
Fazit
In der Mikrobiologie kommt ein Ergebnis nie allein: Es bringt eine Nachweiswahrscheinlichkeit mit, wenn es qualitativ ist, und eine Unsicherheit, wenn es quantitativ ist. Der LOD50 ermöglicht es, Methoden zu vergleichen und zu verstehen, was ein Negativbefund wirklich bedeutet; ISO 19036 ermöglicht es, jeder Zählung ein Intervall zuzuordnen. Diese Spannen zusammen mit einer vereinbarten Entscheidungsregel zu nutzen, verhindert, dass eine Charge wegen eines Unterschieds freigegeben oder abgelehnt wird, den die Methode selbst nicht unterscheiden kann.
Über TAAG
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Häufig gestellte Fragen
Was ist der LOD50 einer mikrobiologischen Methode?
Es ist die Konzentration des Mikroorganismus, bei der eine Nachweismethode in 50 % der analysierten Portionen positiv ausfällt. Er wird verwendet, weil der Nachweis in der Mikrobiologie probabilistisch ist: Selbst eine perfekte Methode erreicht eine Nachweisrate von 50 % erst bei etwa 0,69 KBE im Mittel pro Portion, aufgrund der zufälligen Verteilung der Zellen.
Warum bedeutet ein Ergebnis „nicht nachgewiesen“ nicht null?
Weil die Methode nur eine Portion der Probe analysiert und eine Nachweisgrenze hat. Liegt der Mikroorganismus in niedriger Konzentration oder ungleichmäßig verteilt vor, kann er in der analysierten Portion fehlen oder keine nachweisbaren Niveaus erreichen.
Welche Norm wird zur Schätzung der Unsicherheit einer mikrobiologischen Zählung verwendet?
ISO 19036:2019. Sie kombiniert die technische, die Matrix- und die Verteilungsunsicherheit und gibt das Ergebnis als erweiterte Unsicherheit mit einem Erweiterungsfaktor k = 2 an, ungefähr 95 % Vertrauensniveau.
Umfasst die Messunsicherheit den Probenahmefehler der Charge?
Nein. ISO 19036 schließt die Probenahmeunsicherheit ausdrücklich aus, also den Fehler bei der Entnahme der Probe aus der Charge. Dieses Risiko wird über die Gestaltung des Probenahmeplans gesteuert.