Dieser Artikel ergänzt Was die PCR ist und Extraktion von Nukleinsäuren, wo die PCR-Inhibitoren vorgestellt werden.
Inhaltsverzeichnis
Das Problem des stillen Negativbefunds
Ein positives Ergebnis der PCR hinterlässt eine sichtbare Spur: eine ansteigende Fluoreszenzkurve. Ein Negativbefund dagegen ist das Fehlen dieser Kurve. Und das Fehlen eines Signals hat mehr als eine mögliche Erklärung: dass der Mikroorganismus nicht in der Probe ist oder dass die Reaktion nicht funktioniert hat. Eine durch Bestandteile des Lebensmittels gehemmte Polymerase, ein Pipettierfehler, eine fehlgeschlagene Extraktion oder ein Gerät mit Problemen erzeugen genau dasselbe Bild wie eine saubere Probe.
Deshalb erlaubt eine PCR ohne Kontrollen nicht, ein richtig negatives von einem falsch negativen Ergebnis zu unterscheiden. In der Lebensmittelmikrobiologie ist dieser Unterschied sehr wichtig: Ein falsch negatives Ergebnis für Salmonella oder Listeria monocytogenes bedeutet, ein kontaminiertes Produkt mit einem Bericht freizugeben, der das Gegenteil besagt.
Der Referenzrahmen: ISO 22174 und MIQE
Die Norm ISO 22174 legt die allgemeinen Anforderungen an die Amplifikation von Nukleinsäuren (DNA oder RNA) beim Nachweis von Mikroorganismen und Viren der Lebensmittelkette fest. Ihre zweite Ausgabe von 2024 ersetzte die Fassung von 2005 und drei weitere PCR-Normen (ISO 20837, ISO 20838 und ISO 22119), nahm Anforderungen an die digitale PCR und an die Überwachung der Arbeitsabläufe im Labor auf und erweiterte den Abschnitt zu den Kontrollreaktionen um die Beschreibung der verschiedenen Kontrollen.
Parallel dazu legen die MIQE-Leitlinien (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments), 2025 als MIQE 2.0 überarbeitet, fest, welche Informationen zu Kontrollen, Assay-Design und Datenanalyse dokumentiert werden müssen, damit ein qPCR-Ergebnis reproduzierbar ist. Obwohl sie für wissenschaftliche Veröffentlichungen entstanden sind, sind sie eine gute Checkliste für jedes Labor.
Die Kontrollen, die einen Lauf interpretierbar machen
Interne Amplifikationskontrolle (IAC)
Es ist eine DNA-Sequenz, die nicht zum Zielmikroorganismus gehört und im selben Röhrchen wie die Probe zugesetzt wird, um gleichzeitig amplifiziert zu werden. Amplifiziert die IAC, hat die Reaktion in diesem Röhrchen funktioniert; amplifiziert sie nicht, hat etwas sie verhindert. Hoorfar und Mitarbeiter (2004) fassen es so zusammen: Die IAC erlaubt es, ein richtig negatives Ergebnis von einem PCR-Versagen zu unterscheiden, das durch Inhibitoren, das Gerät oder eine mangelhafte Polymeraseaktivität verursacht wird. Dieselben Autoren weisen darauf hin, dass die Norm EN ISO 22174 ihre Anwesenheit beim PCR-Nachweis lebensmittelübertragener Krankheitserreger verlangt.
Es gibt zwei Designstrategien:
- Kompetitive IAC: teilt die Primerbindungsstellen mit dem Ziel. Sie vermeidet Probleme durch Interferenz zwischen Primern, konkurriert aber um die Reagenzien und kann die Sensitivität verringern.
- Nicht kompetitive IAC: verwendet ein eigenes Primerpaar. Sie erfordert eine sorgfältige Optimierung, damit die Konkurrenz um Reagenzien und Polymerase den Nachweis des Ziels nicht beeinträchtigt, ähnlich der Designherausforderung der Multiplex-PCR.
Die Konzentration der IAC ist entscheidend. Die Autoren empfehlen, sie so niedrig wie möglich zu halten, solange sie ein Signal erzeugt: Eine überhöhte IAC kann eine teilweise Inhibition tolerieren, die ein in geringer Kopienzahl vorhandenes Ziel durchaus beeinträchtigt, und außerdem der Reaktion Ressourcen entziehen.
Positivkontrolle
Eine Reaktion mit dem Erbmaterial des Zielmikroorganismus, die zeigt, dass Primer, Sonden, Reagenzien und das Temperaturprogramm in diesem Lauf nachweisen, was sie nachweisen sollen.
Negativkontrolle und Kontrolle ohne Template (NTC)
Die Kontrolle ohne Template enthält alle Reagenzien, aber keine Nukleinsäure. Amplifiziert sie, liegt eine Kontamination der Reagenzien oder eine Verschleppung von Amplikons aus früheren Läufen vor, und die positiven Ergebnisse dieses Laufs verlieren ihre Glaubwürdigkeit. Eine Negativkontrolle der Extraktion, die von Beginn an zusammen mit den Proben verarbeitet wird, dehnt diese Überwachung auf die gesamte Vorbereitungsphase aus.
Prozesskontrollen
Einige Protokolle fügen eine Kontrolle hinzu, die die Probe ab der Anreicherung oder der Extraktion begleitet, um zu überprüfen, dass der gesamte Prozess (nicht nur die Amplifikation) funktioniert hat. Das ist besonders bei neuen oder schwierigen Matrizes nützlich.
Wie die Kombination der Signale gelesen wird
Mit einer IAC in jedem Röhrchen ordnet sich die Interpretation einer Probe nach dem Schema von Hoorfar und Mitarbeitern in drei Fälle:
- Die IAC amplifiziert, das Ziel nicht: gültiger Negativbefund. Die Reaktion funktionierte und das Ziel war nicht vorhanden.
- Das Ziel amplifiziert, die IAC nicht: gültiger Positivbefund. Liegt das Ziel in großer Menge vor, kann es die IAC im Wettbewerb um Reagenzien verdrängen.
- Keines amplifiziert: ungültiges Ergebnis. Am wahrscheinlichsten ist eine Inhibition oder ein Versagen der Reaktion; es darf nicht als negativ berichtet werden.
All das gilt nur, wenn sich die Kontrollen des Laufs wie erwartet verhalten haben: Die Positivkontrolle amplifizierte und die Kontrolle ohne Template blieb sauber. Fällt eine davon aus, wird der gesamte Lauf überprüft, bevor irgendeine Probe interpretiert wird.
Inhibition: woher sie kommt und was zu tun ist
Die Übersichtsarbeit von Schrader und Mitarbeitern (2012) beschreibt PCR-Inhibitoren als eine vielfältige Gruppe von Stoffen mit unterschiedlichen Eigenschaften und Mechanismen, von denen manche typisch für bestimmte Probenarten sind und die die Sensitivität des Assays verringern oder falsch negative Ergebnisse erzeugen können. Bei Lebensmitteln sind es Matrizes mit viel Fett, Protein, Polysacchariden oder Polyphenolen, wie Schokolade oder Gewürze, die am häufigsten spezifische Vorbereitungsprotokolle erfordern. Die Autoren empfehlen, den Einfluss der Inhibitoren bei jedem einzelnen Assay zu bewerten und nicht anzunehmen, dass ein Protokoll für alle Matrizes taugt.
Wenn die IAC eine Inhibition anzeigt, sind die üblichen Antworten:
- Das Extrakt verdünnen und wiederholen: Das BAM der FDA gibt an, dass bei Screening-Ergebnissen mit Verdacht auf Inhibition die Analyse mit verdünnter Template-DNA wiederholt werden muss. Die Verdünnung verringert den Inhibitor stärker, als sie die Sensitivität verringert, sofern das Ziel nicht nahe an der Nachweisgrenze liegt.
- Die Extraktion verbessern: ein Protokoll verwenden, das für Matrizes mit hoher Inhibitorlast gedacht ist.
- Zur Kulturmethode übergehen: Das BAM legt fest, dass die Kulturmethode abgeschlossen wird, wenn die molekularen Methoden unbestimmte Ergebnisse liefern, und dass die Analyse per Kultur fortgesetzt werden muss, wenn eine angereicherte Probe (Matrix Spike) im Screening negativ ausfällt.
Kontamination: das umgekehrte Risiko
Der andere klassische Fehler ist das falsch positive Ergebnis durch Kontamination. Eine PCR erzeugt Millionen Kopien des amplifizierten Fragments, und eine unsichtbare Menge dieses Produkts an einer Pipette, einem Handschuh oder einer Oberfläche kann den nächsten Lauf kontaminieren. Deshalb trennen Labore die Bereiche für Reagenzienvorbereitung, Extraktion und Amplifikation räumlich, mit Arbeitsfluss in nur einer Richtung. Die Ausgabe 2024 der ISO 22174 nahm genau Anforderungen an die Überwachung dieser Abläufe auf, einschließlich des Umgebungsmonitorings des PCR-Labors selbst. Die Kontrolle ohne Template ist der Alarm der ersten Linie: Amplifiziert sie, ist der Lauf nicht verlässlich.
Kontrollen und automatisierte Interpretation
In einem Labor, das Hunderte Reaktionen pro Tag verarbeitet, ist es langsam und fehleranfällig, jede IAC, jede Positivkontrolle und jede NTC von Hand zu prüfen. Deshalb wendet Interpretationssoftware wie TxA in den Kits von TAAG die Gültigkeitsregeln systematisch an, bevor ein Ergebnis zugewiesen wird. Die Automatisierung ersetzt nicht das Design der Kontrollen, stellt aber sicher, dass die Regeln in allen Läufen und Schichten gleich angewendet werden.
Und selbst wenn alle Kontrollen in Ordnung sind, bleibt ein Screening-Positivbefund in den meisten regulatorischen Schemata präsumtiv. Was danach geschieht, erläutern wir unter Präsumtives vs. bestätigtes Ergebnis.
Fazit
Ein PCR-Negativbefund hat nur dann Wert, wenn die Reaktion gezeigt hat, dass sie positiv ausfallen konnte. Die interne Amplifikationskontrolle in jedem Röhrchen, zusammen mit den Positiv-, Negativ- und Template-freien Kontrollen jedes Laufs, erlaubt es, ein richtig negatives Ergebnis von einer Inhibition und ein richtig positives von einer Kontamination zu trennen. ISO 22174 in der Ausgabe 2024 und die MIQE-2.0-Leitlinien bieten den Rahmen zur Gestaltung dieser Kontrollen; die Verdünnung des Extrakts und der Übergang zur Kultur sind die Auswege, wenn die Matrix die Reaktion hemmt.
Über TAAG
Fragen Sie TAAG, welche Kontrollen die Kits enthalten und wie TxA bei der Interpretation jedes Laufs die Gültigkeitsregeln anwendet.
Häufig gestellte Fragen
Was ist eine interne Amplifikationskontrolle (IAC)?
Es ist eine dem Zielmikroorganismus fremde DNA-Sequenz, die im selben Röhrchen wie die Probe amplifiziert wird. Amplifiziert sie, hat die Reaktion funktioniert; amplifiziert sie nicht und das Ziel ebenfalls nicht, ist das Ergebnis ungültig, wahrscheinlich wegen Inhibition.
Warum kann ein Positivbefund eine nicht amplifizierende IAC haben?
Weil das Ziel, wenn es in großer Menge vorliegt, die IAC im Wettbewerb um die Reagenzien der Reaktion verdrängen kann. In diesem Fall gilt das Ergebnis als gültig positiv.
Was ist zu tun, wenn eine Probe Inhibition zeigt?
Das BAM der FDA gibt an, das Screening mit verdünnter Template-DNA zu wiederholen. Bleiben die molekularen Ergebnisse unbestimmt, wird die Analyse mit der Kulturmethode abgeschlossen.
Was zeigt ein Signal in der Kontrolle ohne Template (NTC) an?
Dass eine Kontamination der Reagenzien oder eine Verschleppung von amplifiziertem Material vorliegt. Die positiven Ergebnisse dieses Laufs sind nicht verlässlich, und der Lauf muss überprüft werden.