Teil der Säule TAAG-Technologie. Ergänzt Ampliora, Elevia und Specio und wie man ein TAAG-Kit auswählt.
Inhaltsverzeichnis
Ein technisches Datenblatt ist ein Vertrag über den Anwendungsbereich
Bevor ein Labor ein PCR-Kit kauft oder einführt, erhält es ein technisches Datenblatt mit rund einem Dutzend Feldern: Format, Inhalt, Fluoreszenzkanäle, Zeiten, Empfindlichkeit, Matrizes, kompatible Geräte, Lagerung und mitunter eine Zertifizierung. Es beschreibt die Bedingungen, unter denen der Hersteller nachgewiesen hat, dass die Methode funktioniert. Außerhalb dieser Bedingungen ist das Ergebnis nicht mehr durch die Validierung gedeckt.
Dieser Artikel geht diese Felder anhand realer Beispiele aus dem TAAG-Katalog durch; sie lassen sich auf das Datenblatt jedes Anbieters übertragen. Die Unterschiede zwischen den Linien erklärt Ampliora, Elevia und Specio, die Auswahl nach Branche wie man ein TAAG-Kit auswählt.
Format und Inhalt: was in der Packung ist
Im Datenblatt von Ampliora 1.1 Salmonella spp. (Code V-SF97) ist als Format SPID für 96 Reaktionen angegeben; der Inhalt besteht aus 12 vorbefüllten PCR-Streifen, einem Röhrchen Positivkontrolle mit 100 µL und einem Röhrchen Negativkontrolle mit 352 µL. Specio 4.1 (V-SF95) wird mit 480 Reaktionen geliefert, mit 60 vorbefüllten Streifen und je fünf Röhrchen jeder Kontrolle.
Zwei Punkte sollten geprüft werden:
- Was enthalten ist und was nicht. Was nicht in der Packung ist (Anreicherungsmedium, Extraktionskit), gehört trotzdem zur Methode. Das Datenblatt von Ampliora 1.1 nennt als zugehörige Produkte das Medium Augmentis 14 Universal Gram negative, das Extraktionskit Nucleia 2 Tez-Q Plus und das Probenahmekit Collectio 1 NeutroSampling. Werden sie ersetzt, ändert sich das bewertete Protokoll.
- Die Kontrollen. Sie zeigen, ob ein Lauf gültig war, wie in Kontrollen einer PCR erklärt.
Nachweischemie und Fluoreszenzkanäle
Sonden oder interkalierender Fluoreszenzfarbstoff
Das Feld zur Chemie gibt an, wie das Signal entsteht. Die Datenblätter von Ampliora geben Fluoreszenzsonden an: ein markiertes Oligonukleotid, das innerhalb der Zielsequenz hybridisiert und mit zunehmender Produktmenge ein Signal erzeugt. Holland und Mitarbeitende beschrieben 1991 diese Art des spezifischen Nachweises während der Amplifikation. Die Datenblätter von Specio geben dagegen einen interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff an, der an jede doppelsträngige DNA bindet. Deshalb ergänzen diese Kits eine Schmelzkurvenanalyse: Laut Ririe, Rasmussen und Wittwer (1997) hängen Form und Lage dieser Kurve vom GC-Gehalt, der Länge und der Sequenz des Produkts ab und erlauben es, Produkte zu unterscheiden, deren Schmelztemperaturen sich um weniger als 2 °C unterscheiden.
Was FAM, HEX, ROX oder Cy5 bedeuten
Das sind die Namen der Fluorophore, und jeder wird in einem anderen optischen Kanal des Thermocyclers gemessen. Ein Sondenkit ordnet jedem Ziel einen Kanal zu und, wenn vorhanden, einen weiteren einer Kontrolle. Einige wörtliche Beispiele aus dem Katalog:
- Ampliora 1.1 Salmonella spp.: FAM und HEX.
- Ampliora 3.5 (Salmonella spp., L. monocytogenes und Listeria spp.): FAM, HEX, ROX und Cy5.
- Ampliora 3.9 (STEC, E. coli O157:H7 und Salmonella spp.): FAM, HEX, ROX, Cy5 und Cy5.5.
- Specio 4.1 (Salmonella spp., L. monocytogenes, E. coli und S. aureus): nur FAM, weil die Unterscheidung über die Schmelzkurve und nicht über die Farbe erfolgt.
Die praktische Frage lautet, ob Ihr Gerät diese Kanäle liest. Bei einem Kit mit einem einzigen Ziel und zwei Kanälen wie Ampliora 1.1 müssen das Datenblatt oder die Gebrauchsanweisung angeben, welcher Kanal dem Mikroorganismus und welcher einer Kontrolle entspricht.
Kompatible Thermocycler
Dieses Feld gibt an, auf welchen Geräten die Leistung verifiziert wurde. Ein Multiplex-Kit setzt voraus, dass das Gerät für jeden Fluorophor einen optischen Kanal hat: Ampliora 3.9 nutzt fünf, der Thermocycler muss also alle fünf lesen, und das Datenblatt nennt den Bio-Rad CFX96.
Der TAAG-Katalog enthält einen Fall, der zeigt, warum dieses Feld wichtig ist. Ampliora 3.5 (V-SF59) gibt Agilent AriaMx und Bio-Rad CFX96 sowie Open qPCR an, mit FAM, HEX, ROX und Cy5. Ampliora 3.5R (V-SF74) sucht dieselben drei Mikroorganismen, gibt aber das QuantStudio 5 Real-Time PCR System an und nutzt FAM, VIC, ROX, TAMRA und Cy5, mit einer PCR-Zeit von 110 statt 100 Minuten. Es ist dasselbe Panel, angepasst an eine andere Plattform: Die beiden sind nicht austauschbar.
Steht der Thermocycler des Labors nicht im Datenblatt, ist diese Anwendung nicht validiert, und die Nachweise müssen beim Hersteller angefordert werden.
PCR-Zeit und Inkubationszeit: nicht dasselbe
Die PCR-Zeit sagt am wenigsten darüber aus, wann das Ergebnis vorliegt. Im Datenblatt von Ampliora 1.1 steht eine PCR-Zeit von 100 Minuten und im Feld Inkubation ein Strich. Das heißt nicht, dass es keine Anreicherung gibt: Das PCR-Kit enthält sie nicht. Die Anreicherung steht im Datenblatt des zugehörigen Mediums, Augmentis 14 Universal Gram negative, das 24 ± 2 Stunden Inkubation angibt. Das Medium Augmentis 91 BPW, das Ampliora 3.9 zugeordnet ist, gibt allgemein 24 ± 2 Stunden und mindestens 8 Stunden für Kakaoproben an.
Um die Zeit bis zum Ergebnis abzuschätzen, müssen mindestens drei Datenblätter addiert werden: das des Mediums, das des Extraktionskits und das des PCR-Kits, zuzüglich der Handhabungszeit. Die PCR-Zeiten im Katalog reichen von 80 Minuten (Ampliora 4.7 Low-pH Microorganisms) bis 120 Minuten (zum Beispiel die Specio-Kits); Elevia 1.1, auf RNA-Basis, gibt 95 Minuten an, ebenso wie Ampliora 2.3.
Empfindlichkeit: was „1 KBE/25 g“ bedeutet
Die Empfindlichkeit eines qualitativen Kits wird fast immer auf eine Analyseportion bezogen: Ampliora 1.1, Ampliora 3.5 und Specio 4.1 geben 1 KBE/25 g in Lebensmitteln an; Ampliora 3.9 und Elevia 1.1 geben 1 KBE/375 g an. Für Oberflächen drücken die Datenblätter von Ampliora 1.1, Ampliora 3.5, Specio 4.1 und Elevia 1.1 die Empfindlichkeit pro Probe aus: 1 KBE/Probe. Das bedeutet nicht, dass die PCR eine Zelle im Röhrchen nachweist, sondern dass das vollständige Protokoll einschließlich Anreicherung sie ausgehend von dieser Kontamination in dieser Portion nachweist. Deshalb sind 375 g und 25 g nicht vergleichbar, ohne das jeweilige Anreicherungsprotokoll zu betrachten.
Manche Datenblätter trennen zwei Empfindlichkeiten. Ampliora 4.3 Yeast gibt 1x10⁰ KBE/mL in angereicherter Probe und 1x10³ Zellen/mL in Direktprobe an: Das sind zwei verschiedene Zahlen, die nicht verwechselt werden dürfen. Und die WaterScan-Panels geben ihre Empfindlichkeit als Bereich an, von 5x10⁰ bis 5x10¹ KBE/mL.
LOD, LOD50 und RLOD
Bei einer qualitativen Methode ist der Nachweis in sehr niedrigen Konzentrationen probabilistisch: Bei wenigen Zellen pro Portion enthalten manche Portionen sie und andere nicht. ISO 16140-2 vergleicht das Nachweisniveau der alternativen Methode mit dem der Referenzmethode über den RLOD, den sie als Quotienten der beiden LOD definiert. Die Studie verwendet künstlich kontaminierte Proben in mindestens drei Konzentrationsstufen; die niedrige Stufe liegt idealerweise beim theoretischen Nachweisniveau von 0,7 KBE pro Portion und muss mit der Referenzmethode 25 % bis 75 % positive Ergebnisse liefern. Die Akzeptanzgrenze liegt bei 1,5 in gepaarten und bei 2,5 in ungepaarten Studien; ein LOD, der niedriger ist als der der Referenzmethode, wird immer akzeptiert. AOAC wiederum drückt die Leistung als Nachweiswahrscheinlichkeit (POD) aus: den Anteil positiver Ergebnisse für eine gegebene Matrix und Analytkonzentration. LOD50 und seine Unsicherheit werden in Nachweisgrenze und LOD50 vertieft.
Inklusivität und Exklusivität: die Spezifität in Zahlen
Ein Datenblatt kann „Nachweis von Salmonella spp.“ angeben, doch diese Aussage beruht auf einer konkreten Studie:
- Inklusivität. Die Fähigkeit der Methode, den Zielmikroorganismus in einem breiten Spektrum von Stämmen nachzuweisen. ISO 16140-2 verlangt mindestens 50 Reinkulturen des Ziels und bei Salmonella-Methoden mindestens 100 Kulturen verschiedener Serotypen. Jeder Stamm wird in einer Konzentration vom 10- bis 100-Fachen des minimalen Nachweisniveaus der Methode inokuliert und mit dem vollständigen Protokoll einschließlich Anreicherung bearbeitet.
- Exklusivität. Das Fehlen einer Störung durch relevante Nicht-Zielstämme. ISO 16140-2 verlangt mindestens 30 Reinkulturen von Nicht-Zielorganismen. AOAC definiert sie als Studie mit potenziell kreuzreaktiven Nicht-Zielstämmen, die nicht nachgewiesen werden dürfen.
Die Norm verlangt zudem, die Stämme nach dem Messprinzip der Methode auszuwählen. Beim Lesen eines Datenblatts lautet die nützliche Frage, mit wie vielen Stämmen und Serotypen der Nachweis belegt wurde und gegen welche Nicht-Ziele. Diese Angabe steht meist im Validierungsbericht, nicht im zusammengefassten Datenblatt, und es ist sinnvoll, sie anzufordern.
Validierte Matrizes: das Feld, das den tatsächlichen Anwendungsbereich festlegt
Die Matrizes in den TAAG-Datenblättern sind konkret. Ampliora 1.1 gibt rohen Hähnchenschenkel, tiefgekühlten Rindfleisch-Burger, Wurst (Longanicilla), Mortadella und Oberfläche an. Ampliora 3.9 gibt Kohl, Kopfsalat, Spinat, eine Blattgemüsemischung (Kopfsalat, Kohl und Spinat zu gleichen Teilen) und rohes Rinderhackfleisch (80 % mager) an. Specio 4.1 listet eine lange Reihe von Fertiggerichten, Fleisch- und Milchprodukten, pasteurisiertem Flüssigei sowie belebten und unbelebten Oberflächen, und seine AOAC-Matrizes sind Edelstahloberflächen, pasteurisierte Flüssigmilch mit 2 % Fett und Blattgemüse (Kopfsalat). Elevia 1.1 gibt gefüllte Schokolade vom Typ Haselnuss, gefüllte Schokolade vom Typ Milch, Schokoladenriegel mit Erdnüssen, Haselnuss-Kakao-Creme, ganzes Muskelfleisch, Rinderhackfleisch (90 % mager), Futtermittelpellets, pasteurisiertes Flüssigei und Edelstahloberflächen an.
Das ist aus zwei Gründen wichtig. Der erste ist die Inhibition: Eine Übersichtsarbeit des Bundesinstituts für Risikobewertung (Schrader und Mitarbeitende, 2012) beschreibt, dass in der Probe vorhandene inhibitorische Substanzen die Empfindlichkeit der PCR verringern oder falsch-negative Ergebnisse verursachen können und dass einige für bestimmte Probenarten typisch sind, was matrixspezifische Extraktionsprotokolle erfordert. Der zweite sind die Begleitflora und der Zustand der Zellen: ISO 16140-2 verlangt, dass eine Validierung Erzeugnisse mit hoher und niedriger Hintergrundflora, unterschiedlichen Prozessbelastungen und rohe Erzeugnisse umfasst.
Die Norm legt auch den Anwendungsbereich fest: Wird eine Methode für eine „breite Palette von Lebensmitteln“ angegeben, müssen mindestens fünf Kategorien mit mindestens drei Typen pro Kategorie untersucht werden. Die Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 lässt alternative Methoden zu, die gegen die Referenzmethode validiert sind und, sofern es sich um geschützte Methoden handelt, von einem Dritten nach ISO 16140 oder anderen ähnlichen internationalen Protokollen zertifiziert wurden. Erscheint Ihr Produkt nicht unter den Matrizes, sagt das Datenblatt nicht, dass das Kit versagt: Es sagt, dass es noch niemand nachgewiesen hat. Die Verifizierung im eigenen Labor nach ISO 16140-3 erklärt Validierung und Verifizierung von Methoden.
Lagerung und Haltbarkeit
Alle PCR-Kits im TAAG-Katalog werden zwischen -25 °C und -15 °C gelagert. Die angegebene Haltbarkeit beträgt bei den meisten 9 Monate (zum Beispiel Ampliora 1.1, Ampliora 3.9 und Specio 4.1) und bei den Elevia-Kits 6 Monate. Die Medien haben eigene Bedingungen: Augmentis 14 wird zwischen 2 °C und 25 °C gelagert und ist 6 Monate haltbar, Nucleia 2 Tez-Q Plus zwischen 2 °C und 25 °C mit 12 Monaten. Die kürzeste Haltbarkeit des gesamten Sets bestimmt die Beschaffung.
Zertifizierungen und Version des Datenblatts
Ampliora 3.9 gibt „Certified by AOAC by extension of License Number 032501“ an und Specio 4.1 „Certified by AOAC by extension of License Number 072101“. Das auf taag.bio veröffentlichte Datenblatt von Elevia 1.1 ergänzt „Certified by AOAC by extension of License Number 072601“, mit einem PTM-Anwendungsbereich für Schokolade mit 62 % Kakao, Kakaomasse, Magermilchpulver und Erdnüsse (jeweils 375 g) sowie Edelstahloberflächen von 100 cm², ohne das Protokoll „zero“. Der zertifizierte Anwendungsbereich und die Liste der validierten Matrizes sind unterschiedliche Felder und müssen nicht übereinstimmen. Das Wort „extension“ zeigt an, dass der Anwendungsbereich einer bestehenden Lizenz erweitert wurde, und jede Zertifizierung deckt die in dieser Studie bewerteten Matrizes und Ziele ab, wie in was die AOAC-PTM-Zertifizierung ist erklärt. Bei einem Audit sind Lizenznummer, zertifizierte Matrizes und die tatsächliche Matrix des Labors abzugleichen.
Die Datenblätter haben zudem eine Revisionsnummer und ein Revisionsdatum. Das von Ampliora 1.1 liegt zum Beispiel in Revision 4 vom 7. Oktober 2025 vor. Es empfiehlt sich, die gültige Version zusammen mit den Verifizierungsaufzeichnungen abzulegen.
Welche TAAG-Kits und -Technologien in diesem Artikel vorkommen
Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97) und Ampliora 3.9 (V-SF68) sind Real-Time-PCR-Kits mit Fluoreszenzsonden, die mit Mila entworfen wurden; Specio 4.1 (V-SF95) nutzt einen interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff mit einer Schmelzkurve, die mit KAi interpretiert wird; Elevia 1.1 Salmonella spp. (V-PAT04) ist eine RT-qPCR auf RNA-Basis mit AiGOR-Technologie. In allen vier Fällen gibt das Datenblatt an, dass die Software TxA die Kurven automatisch interpretiert. Stimmen Matrix oder Gerät des Labors nicht mit den Angaben überein, ist vor der Verwendung des Ergebnisses eine Verifizierung erforderlich.
Fazit
Das technische Datenblatt eines PCR-Kits beschreibt die Bedingungen, unter denen die Methode nachgewiesen wurde: mit welchem Medium und welcher Extraktion, auf welchem Gerät und mit welchen Kanälen, für welche Portion und welche Matrizes und mit welcher Studie zu Inklusivität, Exklusivität und Nachweisniveau. Es richtig zu lesen bedeutet, die PCR-Zeit von der Gesamtzeit zu trennen, zu verstehen, dass sich die Empfindlichkeit auf eine Portion und ein vollständiges Protokoll bezieht, und Matrizes und Zertifizierung mit dem abzugleichen, was das Labor tatsächlich untersucht. Stimmt etwas nicht überein, sagt das Datenblatt nicht, dass das Kit versagt, sondern dass es verifiziert werden muss, bevor auf Grundlage seines Ergebnisses entschieden wird.
Über TAAG
Prüfen Sie mit TAAG das technische Datenblatt von Ampliora 1.1 Salmonella spp., Ampliora 3.9 oder Specio 4.1 im Hinblick auf Ihre Matrix und Ihren Thermocycler.
Häufig gestellte Fragen
Ist die PCR-Zeit im Datenblatt die Gesamtzeit bis zum Ergebnis?
Nein. Die PCR-Zeit bezieht sich nur auf den Lauf im Thermocycler. Zur Gesamtzeit kommen die Anreicherung hinzu, die im Datenblatt des Nährmediums angegeben ist (zum Beispiel 24 ± 2 Stunden bei Augmentis 14 Universal Gram negative), die Extraktion und die Handhabung.
Was bedeutet eine Empfindlichkeit von 1 KBE/25 g?
Dass das vollständige Protokoll mit seiner Anreicherung den Mikroorganismus ausgehend von dieser Kontamination in einer Portion von 25 g nachweist. Es bedeutet nicht, dass die PCR eine einzelne Zelle im Röhrchen nachweist, und der Nachweis in so niedrigen Konzentrationen ist probabilistisch, weshalb die Normen ihn mit LOD50, RLOD oder POD bewerten.
Was sind Inklusivität und Exklusivität eines Kits?
Inklusivität ist die Fähigkeit, den Zielmikroorganismus in vielen verschiedenen Stämmen nachzuweisen; ISO 16140-2 verlangt mindestens 50 Stämme und bei Salmonella 100 Serotypen. Exklusivität bedeutet, dass die Methode nicht auf relevante Nicht-Zielstämme reagiert; die Norm verlangt mindestens 30.
Kann ich ein Kit für eine Matrix verwenden, die nicht im Datenblatt steht?
Das ist möglich, doch diese Anwendung ist nicht durch die Validierung des Herstellers gedeckt. Bevor das Ergebnis für Entscheidungen genutzt wird, muss das Labor die Methode in seiner Matrix verifizieren, zum Beispiel nach ISO 16140-3, weil sich die PCR-Inhibition und die Begleitflora von Lebensmittel zu Lebensmittel unterscheiden.
Funktioniert ein Kit auf jedem Real-Time-Thermocycler?
Nicht unbedingt. Das Gerät muss die Fluoreszenzkanäle lesen, die das Kit verwendet, und zu den Geräten gehören, auf denen die Leistung verifiziert wurde. Im TAAG-Katalog suchen Ampliora 3.5 und Ampliora 3.5R dieselben Mikroorganismen, geben aber unterschiedliche Plattformen und Fluorophore an.