Von der Laborprobe zur Analysenportion: Vorbereitung nach ISO 6887, Erstverdünnung und Pooling für Krankheitserreger

Der Schritt, den im Prüfbericht niemand sieht

Ein mikrobiologisches Ergebnis wird als „nicht nachgewiesen in 25 g“ oder „3.200 KBE/g“ berichtet, doch zwischen dem Beutel, der im Labor ankommt, und der Platte oder der Bouillon liegt ein Schritt, der im Bericht fast nie auftaucht: die Probenvorbereitung. Wie viel eingewogen wird, in welchem Verdünnungsmittel, wie lange homogenisiert wird, wie lange die Suspension wartet und ob Portionen zusammengefasst werden: Jede Entscheidung verändert, was die Zahl bedeutet. Die Probenahme im Betrieb wird in Probenahme von Oberflächen behandelt und der Weg ins Labor in Transport und Lagerung von Proben; dieser Artikel beginnt dort, wo jene enden, mit der bereits eingegangenen Probe.

Die internationale Referenz für diesen Schritt ist die Normenreihe ISO 6887 des Komitees ISO/TC 34/SC 9. Sie hat sechs Teile: 6887-1:2017 legt die allgemeinen Regeln fest, und die übrigen fünf konkretisieren sie für Produktgruppen: Fleisch (6887-2:2017), Fisch und Fischereierzeugnisse (6887-3:2017), verschiedene Erzeugnisse wie Eier, Gemüse, Kakao, Kräuter und Gewürze (6887-4:2017), Milch und Milcherzeugnisse (6887-5:2020) sowie Proben aus der Primärproduktion, vom Betrieb bis zum Schlachthof (6887-6:2013). Enthält das spezifische Verfahren für einen Mikroorganismus eigene Anweisungen, haben diese Vorrang.

Die Erstverdünnung 1:10 Schritt für Schritt

Einwaage und Verhältnis

ISO 6887-1 verlangt, die Analysenportion mit einer Toleranz von ±5 % abzuwiegen oder abzumessen, mit mindestens 10 g oder 10 mL, sofern das Verfahren nichts anderes vorgibt, und die neunfache Menge Verdünnungsmittel zuzugeben, vorzugsweise gravimetrisch mit einer Toleranz von ±2 % abgemessen. So erhält man die Verdünnung 1:10. Die Norm lässt bei Bedarf andere Verhältnisse zu: 1 zu 20, 1 zu 50 oder 1 zu 100 für Erzeugnisse, die zu dicke Suspensionen ergeben, und 1 zu 2 oder 1 zu 5, wenn niedrige Keimzahlen gesucht werden, weist aber darauf hin, dass Letztere das Verhältnis zwischen Inokulum und Medium aus dem Gleichgewicht bringen können und im Einzelfall verifiziert werden müssen. Jedes vom Standard abweichende Verhältnis geht in die Endberechnung ein.

Verdünnungsmittel

Für den allgemeinen Gebrauch definiert die Norm zwei Verdünnungsmittel: die Pepton-Kochsalz-Lösung (1 g enzymatisches Caseinhydrolysat und 8,5 g Natriumchlorid pro Liter) und das gepufferte Peptonwasser, beide mit einem End-pH-Wert von 7,0 ± 0,2 bei 25 °C. Daneben gibt es eine doppelt konzentrierte Version des gepufferten Peptonwassers für sehr saure Erzeugnisse. Das Endvolumen darf nicht mehr als ±2 % abweichen, und die Verdünnungsmittel müssen eine Leistungsprüfung bestehen: Nach 45 Minuten bis 1 Stunde bei Raumtemperatur muss die Keimzahl des Kontrollstamms innerhalb von ±30 % des Ausgangswerts liegen. Die Leistungsanforderungen an Verdünnungsmittel und Nährmedien sind in ISO 11133 festgelegt.

Homogenisierung

Die Mischung wird nach ISO 7218 (vierte Ausgabe, 2024) homogenisiert, mit einem Rotationshomogenisator (Labormixer) oder einem peristaltischen Homogenisator, dem Paddelgerät, das auf einen sterilen Beutel schlägt und im Labor meist Stomacher genannt wird. Bei Bedarf lässt man grobe Partikel bis zu 15 Minuten absetzen; Beutel mit integriertem Filter sind eine gleichwertige Alternative. Bei harten oder trockenen Erzeugnissen begrenzt die Norm den Rotationshomogenisator auf 2,5 Minuten am Stück und das vorherige Zerkleinern oder Mahlen auf 1 Minute, um eine Erwärmung der Probe zu vermeiden. Das Handbuch der FDA für Lebensmittel (BAM, Kapitel 1) verwendet für Keimzählungen 50 g Probe in 450 mL Butterfield-Phosphatpuffer, 2 Minuten lang gemixt.

Höchstzeiten

ISO 6887-1 legt fest, dass zwischen dem Ende der Herstellung der Erstverdünnung und dem Kontakt des Inokulums mit dem endgültigen Nährmedium nicht mehr als 45 Minuten vergehen dürfen und zwischen Erstverdünnung und Beginn der Verdünnungsreihe nicht mehr als 30 Minuten. Liegt die Labortemperatur über 27 °C, sollten beide Zeiten verkürzt werden. Das BAM ist strenger: höchstens 15 Minuten von der Homogenisierung, bis alle Verdünnungen in ihren Medien sind. In einer nährstoffreichen Suspension können sich die Mikroorganismen zu vermehren beginnen, und das Ergebnis fällt höher aus als in der tatsächlichen Probe.

Dezimale Verdünnungen

Für jede Dezimalstufe wird 1 mL ± 0,02 mL in ein Röhrchen mit 9 mL ± 0,2 mL Verdünnungsmittel überführt, ohne die Pipette mehr als 1 cm einzutauchen, 5 bis 10 Sekunden gemischt und für jeden Schritt eine neue Spitze verwendet.

Regeln nach Lebensmittelart

Tiefgefrorenes

Für kleine Packungen (in der Regel unter 2 kg) erlaubt ISO 6887-1, sie auf eine Konsistenz zu bringen, die die Entnahme der Portion zulässt, bei 18-27 °C für höchstens 3 Stunden oder bei 5 ± 3 °C für höchstens 24 Stunden, und rät vom Auftauen im Wasserbad oder unter fließendem Wasser ab, weil bei nicht dichter Verpackung Kontaminationsgefahr besteht. Das BAM zieht es vor, nicht aufzutauen, und tut es bei Bedarf bei 2-5 °C innerhalb von höchstens 18 Stunden oder unter 45 °C für höchstens 15 Minuten unter Schütteln im thermostatisierten Bad.

Fleisch

ISO 6887-2 umfasst frisches, gekühltes, tiefgefrorenes, gepökeltes, fermentiertes und zerkleinertes Fleisch, Fleischzubereitungen, Separatorenfleisch, gegartes, getrocknetes und geräuchertes Fleisch, konzentrierte Extrakte sowie Schlachtkörperproben, die durch Exzision oder Tupferabstrich entnommen wurden. Unterschieden werden unter anderem Blöcke und Teilstücke, Würste mit Hülle und Oberflächen- oder Tiefenproben. Die Probenahme am Schlachtkörper ist Gegenstand von ISO 17604. Den Branchenkontext bietet Mikrobiologie in der Fleischindustrie.

Milchprodukte

ISO 6887-5 hat eigene Verfahren für flüssige Milch, Milch- und Molkenpulver, Käse, Caseine und Caseinate (mit einem Sonderfall für Labcasein), Butter, Speiseeis, Milchdesserts mit einem pH-Wert über 5, fermentierte Milch und Joghurt mit einem pH-Wert unter 5 sowie Säuglingsanfangsnahrung in Pulverform. Das BAM veranschaulicht, warum nicht alles gleich behandelt werden kann: Für Salmonella in Käse mixt es 25 g mit 225 mL Lactosebouillon 2 Minuten lang, lässt 60 Minuten stehen und stellt den pH-Wert auf 6,8 ± 0,2 ein; instantisiertes Magermilchpulver dagegen wird vorsichtig auf die Oberfläche der Bouillon gegeben und ohne Mischen bebrütet.

Fisch und Meeresfrüchte

ISO 6887-3 umfasst ganzen Fisch oder Filets, Krebstiere, Kopffüßer, Muscheln, Schnecken, Manteltiere und Stachelhäuter sowie geräucherte, gegarte und tiefgefrorene Blockware und enthält Sonderverfahren für rohe Muscheln, Manteltiere und Stachelhäuter aus Erzeugungsgebieten der Primärproduktion.

Trockene, saure und fettreiche Lebensmittel

• Niedrige Feuchte: zuerst das Verdünnungsmittel einwiegen und dann die Portion zugeben, um den osmotischen Schock zu verringern, und harte Erzeugnisse bis zu 1 Stunde einweichen lassen. Das BAM gibt bei Pulvern zunächst etwa 15 mL Bouillon zu, bildet eine klumpenfreie Suspension und füllt das Volumen portionsweise auf.
• Saure Erzeugnisse: Die Suspension muss wieder einen pH-Wert von 7,0 ± 0,5 erreichen. Gepuffertes Peptonwasser genügt für Erzeugnisse mit pH 4,5 oder höher; zwischen pH 3,5 und 4,5 kann die doppelt konzentrierte Version verwendet werden, wobei der pH-Wert beim ersten Mal zu überprüfen ist.
• Fettreiche Erzeugnisse (über 20 %): Dem Verdünnungsmittel kann Polysorbat 80 mit 1 bis 10 g/L zugesetzt werden; im Allgemeinen genügt 1 g/L je 10 % Fett.
• Hemmende Gewürze: Das BAM setzt bei getrockneten Zwiebeln und getrocknetem Knoblauch 0,5 % Kaliumsulfit zu und verdünnt Piment, Zimt und Oregano auf 1:100 und Gewürznelken auf 1:1000, weil keine Möglichkeit bekannt ist, ihre Wirkung zu neutralisieren.

Mischproben und gepoolte Proben: nicht dasselbe

Einheiten derselben Charge zusammenzufassen spart Arbeit und Reagenzien. Die Änderung 1 von 2024 zu ISO 6887-1 präzisiert zwei Begriffe, die in der Praxis verwechselt werden:

• Mischprobe: Mehrere Einheiten werden gemischt, und aus der Mischung wird eine Portion in der vom Verfahren vorgegebenen Größe entnommen, zum Beispiel 25 g. Das Ergebnis wird weiterhin auf 25 g bezogen.
• Gepoolte Probe (Pooling): Mehrere Einheiten oder Portionen werden zusammengeführt, und die gesamte Mischung wird untersucht. Das Ergebnis wird auf die Gesamtmasse bezogen, zum Beispiel 100 g oder 375 g.

Gepoolt werden kann außerhalb des Labors, indem Einzelproben zu einer größeren vereinigt werden, oder im Labor, indem Portionen in einer einzigen großen Voranreicherung oder bereits vorangereicherte Bouillons zusammengeführt werden. Es gibt feste Regeln: nur für qualitative Prüfungen, nur mit Einheiten derselben Herkunft (gleiche Charge oder Partie) und ohne zwei Varianten gleichzeitig zu kombinieren, etwa Portionen zu poolen und anschließend auch deren Bouillons.

25 g oder 375 g: was sich bei einer größeren Portion ändert

Das klassische Schema stammt aus dem BAM: Aus jeder Probeneinheit wird eine Portion von 25 g entnommen, und bis zu 15 Portionen können zu einer Sammelprobe von 375 g vereinigt werden, die unter Beibehaltung des Verhältnisses 1:9 vollständig untersucht wird (375 g in 3.375 mL Bouillon). Die Zahl der Einheiten hängt von der Lebensmittelkategorie ab: 60 für Kategorie I (ohne letalen Schritt und für ältere, kranke Menschen oder Säuglinge bestimmt), 30 für Kategorie II und 15 für Kategorie III, also 4, 2 oder 1 Sammelprobe von 375 g. Ein einziger Positivbefund führt zur Ablehnung der Charge. Das BAM schließt unter anderem nicht instantisiertes Milchpulver und Vollmilchpulver von der Zusammenfassung aus.

Die Änderung von 2024 stellt technische Bedingungen auf, damit das große Volumen keinen Positivbefund verdeckt:

• Die Voranreicherungsbouillon muss auf Bebrütungstemperatur vorgewärmt sein.
• Das Temperaturprofil des großen Volumens muss bekannt sein. Am Beispiel von ISO 6579-1, deren Voranreicherung 16 bis 20 Stunden dauert, muss die Mischung mindestens 16 Stunden zwischen 34 °C und 38 °C gehalten werden, und die Zeit bis zum Erreichen dieser Temperatur ist zu minimieren.
• Das Verhältnis Probe/Verdünnungsmittel des validierten Verfahrens wird nicht verändert, außer um es bei hemmenden Matrizes wie Zwiebelpulver, Knoblauch, Oregano, Paprika, manchen Tees und Kaffees, Vitaminvormischungen oder sehr salzigen Erzeugnissen zu erhöhen.
• Eine Laborprobe, die größer als das Maximum ist, wird aufgeteilt: 750 g werden als zwei Portionen von 375 g verarbeitet.

Außerdem muss die größere Portion validiert sein. Wurde sie in einer Studie nach ISO 16140-2 oder ISO 16140-5 validiert, muss jedes Labor sie nur nach ISO 16140-3 innerhalb derselben Lebensmittelkategorie verifizieren; andernfalls muss es sie selbst mit dem Protokoll in Anhang H der Änderung 1:2024 zu ISO 16140-4 validieren und anhand des relativen Nachweisniveaus (RLOD) zeigen, dass sich die LOD50 nicht verschlechtert. Sind 375 g validiert, können kleinere Portionen im selben Verhältnis verwendet werden. Diese Begriffe werden in Validierung und Verifizierung von Methoden erklärt.

Die Evidenz stützt diesen Ansatz, wenn er richtig umgesetzt wird. Tomás Fornés und Kollegen validierten das Poolen von Portionen bis 375 g für Salmonella mit fünf Verfahren (Kultur, ELISA und Real-Time-PCR) in 23 Lebensmitteln (unter anderem Süßwaren, Säuglingsanfangsnahrung, Heimtierfutter und Getränkepulver). Bei 22 der 23 war die RLOD50 gegenüber 25 g akzeptabel (unter 2,5), unter der Bedingung, die Bouillon vorzuwärmen und die maximale Bebrütungszeit einzuhalten. Das Poolen findet sich auch in den Rechtsvorschriften: Die Verordnung (EG) 2073/2005 verlangt, die Halshaut von mindestens drei Geflügelschlachtkörpern derselben Herkunftsherde zu einer Probe von 26 g zusammenzufassen und die Tupferproben verschiedener Stellen eines Schlachtkörpers vor der Analyse zu poolen. Wie n und c in diesen Plänen zu lesen sind, steht in attributive Stichprobenpläne, und warum der Bouillonschritt entscheidend ist, in mikrobiologische Anreicherung.

Welche TAAG-Kits und -Nährmedien sich darauf beziehen

Das Kit legt fest, für welche Portion es validiert ist. Im TAAG-Katalog gibt Elevia 1.1 Salmonella spp. (V-PAT04, RT-qPCR mit AiGOR-Technologie) eine Sensitivität von 1 KBE/375 g in Lebensmitteln und 1 KBE/Probe auf Oberflächen an; seine AOAC-Zertifizierung deckt Portionen von 375 g Schokolade mit 62 % Kakao, Kakaomasse, Magermilchpulver und Erdnüssen ab, und TAAG gibt außerdem validierte Matrizes wie gefüllte Schokolade, Rinderhackfleisch (90 % mager), Futtermittelpellets, pasteurisiertes Flüssigei und Edelstahloberflächen an. Sein Datenblatt führt das Supplement Potentia 1 Salmonella spp. (V-PET06) auf, einen Wachstumsverstärker für gepuffertes Peptonwasser. Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97, Real-Time-PCR) gibt 1 KBE/25 g an, mit validierten Matrizes rohe Hähnchenschenkel, tiefgefrorene Rindfleisch-Burger, Wurst vom Typ Longaniza, Mortadella und Oberflächen, und ist Augmentis 14 Universal Gram negative (V-FL46, Flaschen mit 225 mL, das Bouillonvolumen für 25 g bei 1:10) zugeordnet. Ein Kit mit einer Portion, einer Matrix oder einem Pooling-Schema einzusetzen, die von den angegebenen abweichen, erfordert die Verifizierung oder Validierung, die die Änderung zu ISO 6887-1 verlangt. Zur Auswahl nach Matrix siehe wie man ein TAAG-Kit auswählt.