Dieser Artikel ergänzt was KBE sind und die traditionelle mikrobiologische Kultur: Er erklärt das andere große Zählverfahren, das mit Röhrchen und Wahrscheinlichkeiten arbeitet.
Inhaltsverzeichnis
Zählen, ohne Kolonien zu sehen
Die Plattenzählung erfasst, was sichtbar ist: Jede Kolonie auf dem Agar wird als eine koloniebildende Einheit angenommen, wie in was KBE sind und wie man sie interpretiert erklärt. Das Verfahren der wahrscheinlichsten Keimzahl (Most Probable Number, MPN) gelangt auf anderem Weg zu einer Zahl. Es zählt keine Kolonien: Es verteilt die Probe auf mehrere Röhrchen mit Bouillon, beobachtet, in welchen Wachstum auftritt, und berechnet aus dieser Kombination positiver und negativer Röhrchen die Konzentration, die dieses Ergebnis am wahrscheinlichsten hervorgebracht hat.
Anhang 2 des Bacteriological Analytical Manual (BAM) der FDA schreibt McCrady im Jahr 1915 die erste genaue Schätzung lebensfähiger Bakterien auf diesem Weg zu. Das Verfahren ist bis heute in Gebrauch, weil es Situationen löst, in denen die Platte versagt: niedrige Konzentrationen, Lebensmittel mit Partikeln, die sich mit Kolonien verwechseln lassen, und Mikroorganismen, die vor ihrer Isolierung eine Anreicherung benötigen.
Das statistische Prinzip
Die Idee besteht darin, so weit zu verdünnen, dass einige Röhrchen mindestens eine lebensfähige Zelle erhalten und andere keine. Sind die Bakterien zufällig verteilt, folgt die Zahl der Zellen pro Röhrchen einer Poisson-Verteilung, und die Wahrscheinlichkeit, dass ein Röhrchen keine Zelle erhält, hängt nur von der Konzentration und der beimpften Probenmenge ab. Mit mehreren dezimalen Verdünnungsstufen und mehreren Röhrchen pro Stufe lässt sich aus dem Muster der positiven Röhrchen die ursprüngliche Konzentration schätzen. Die MPN ist im wörtlichen Sinn der Konzentrationswert, der das beobachtete Ergebnis am wahrscheinlichsten macht; die Gleichung wird iterativ gelöst.
Die Annahmen, die erfüllt sein müssen
Das BAM nennt vier Bedingungen, unter denen die Schätzung gültig ist:
- Die Bakterien sind in der Probe zufällig verteilt.
- Sie liegen vereinzelt vor, nicht in Gruppen, und stoßen einander nicht ab.
- Jedes Röhrchen, das auch nur einen lebensfähigen Organismus erhält, zeigt Wachstum oder eine nachweisbare Veränderung.
- Die Röhrchen sind voneinander unabhängig.
Die dritte Annahme ist die anspruchsvollste: Das Medium muss einer einzelnen, mitunter geschädigten Zelle das Wachstum gegenüber der Begleitflora ermöglichen. Deshalb bestimmen die Qualität der Bouillon und der Anreicherungsschritt das Ergebnis unmittelbar. Zudem erfasst die MPN nur lebensfähige Organismen. Bilden die Bakterien Ketten oder Gruppen, die durch die Verdünnung nicht getrennt werden, ist das Ergebnis laut BAM als Wachstumseinheiten oder KBE zu lesen, nicht als einzelne Zellen.
Reihen mit 3, 5 und 10 Röhrchen
Am häufigsten veröffentlicht ist das Schema aus drei aufeinanderfolgenden dezimalen Verdünnungsstufen mit jeweils 3, 5, 8 oder 10 Röhrchen; Anhang 2 enthält Tabellen für diese Schemata, berechnet für Inokula von 0,1, 0,01 und 0,001 g. Kapitel 4 des BAM über coliforme Keime und E. coli gibt an, dass die 3-Röhrchen-Reihe für die meisten Lebensmittel verwendet wird, dass bei Muscheln nicht weniger als 5 Röhrchen pro Verdünnungsstufe eingesetzt werden dürfen und dass es ein 10-Röhrchen-Verfahren für abgefülltes Wasser oder Proben gibt, bei denen keine starke Kontamination zu erwarten ist.
Mehr Röhrchen bedeuten mehr Information pro Verdünnungsstufe und damit engere Intervalle und eine niedrigere Untergrenze. Mit den BAM-Tabellen und Inokula von 0,1, 0,01 und 0,001 g wird das Ergebnis mit ausschließlich negativen Röhrchen in der 3-Röhrchen-Reihe als kleiner als 3,0 MPN/g und in der 5-Röhrchen-Reihe als kleiner als 1,8 MPN/g angegeben. Die obere Grenze des Konfidenzintervalls dieses Nullergebnisses sinkt von 9,5 auf 6,8 und mit 10 Röhrchen auf 3,1 MPN/g.
Wie man die Tabellen liest
Das Ergebnis wird als dreistelliger Code angegeben: die Zahl der positiven Röhrchen in jeder der drei gewählten Verdünnungsstufen. In der 3-Röhrchen-Tabelle entspricht der Code 3-1-0 einem Wert von 43 MPN/g mit einem 95-%-Konfidenzintervall von 9 bis 180. Waren die verwendeten Inokula zehnmal kleiner als in der Tabelle (0,01, 0,001 und 0,0001 g), werden der Wert und seine Grenzen mit 10 multipliziert: 430 MPN/g. Dieselbe Regel gilt in umgekehrter Richtung: Größere Beimpfungsmengen senken die Bestimmungsgrenze.
Werden mehr als drei Verdünnungsstufen angesetzt, beschreibt das BAM ein Verfahren zur Auswahl der drei Stufen, die in die Tabelle übernommen werden. Kurz gesagt werden die höchsten Verdünnungsstufen verworfen, die zusammen mit der vorhergehenden nur negative Röhrchen aufweisen, und es wird die höchste Verdünnungsstufe gesucht, in der alle Röhrchen positiv sind. Die FDA stellt zudem eine Berechnungsanwendung und eine Tabellenvorlage zur Auswahl der Verdünnungsstufen bereit.
Die Tabellen lassen Kombinationen weg, die so unwahrscheinlich sind, dass sie auf einen Laborfehler oder eine Kontamination hindeuten. Steht der erhaltene Code nicht in der Tabelle, behandelt das BAM ihn als unwahrscheinliches Ergebnis: Er kann auf Störungen in den niedrigen Verdünnungsstufen oder auf die Bestätigung zu weniger Kolonien zurückgehen, und ist die Ursache unbekannt, ist die Schätzung möglicherweise nicht verlässlich.
Konfidenzintervalle: Die Zahl kommt mit einer großen Spannweite
Eine MPN ist immer zusammen mit ihrem Intervall zu lesen. In der 5-Röhrchen-Reihe ergibt der Code 5-2-0 einen Wert von 49 MPN/g mit einem 95-%-Intervall von 15 bis 150: Der wahre Wert kann in einem Bereich liegen, der etwa einen Faktor zehn umfasst. Das BAM definiert dieses Intervall so: Vor dem Beimpfen der Röhrchen beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass das resultierende Intervall die wahre Konzentration enthält, mindestens 95 %. Die Tabellen verwenden eine Abwandlung der Methode von de Man (1983); die Excel-Tabelle der FDA nutzt eine Normalapproximation des Logarithmus der MPN, sodass ihre Intervalle von denen der Tabellen abweichen können.
Mehrere Autoren haben beschrieben, dass die MPN die Konzentration tendenziell überschätzt. Das BAM zitiert die Arbeit von Garthright (1993), die zeigte, dass diese Verzerrung nicht ins Gewicht fällt, wenn die Ergebnisse logarithmisch ausgedrückt werden, die übliche Form, um Daten zu vergleichen und zusammenzuführen. Wie Messunsicherheit, Nachweisgrenze und Konformitätsentscheidung zusammenwirken, erklärt Nachweisgrenze und Messunsicherheit.
Wo die MPN in der Lebensmittelindustrie eingesetzt wird
Coliforme Keime und E. coli in Lebensmitteln
Das klassische BAM-Verfahren hat drei Phasen. In der präsumtiven Phase werden die Verdünnungen in Laurylsulfat-Tryptose-Bouillon (LST) angesetzt und bei 35 °C bebrütet; die Gasbildung wird nach 24 und nach 48 Stunden abgelesen. In der Bestätigungsphase für coliforme Keime wird jedes Röhrchen mit Gas in Brillantgrün-Galle-Laktose-Bouillon (BGLB) bei 35 °C überführt, für fäkalcoliforme Keime und E. coli in EC-Bouillon bei 44,5 °C. Die vollständige Phase für E. coli ergänzt eine Isolierung auf L-EMB-Agar und biochemische Tests (IMViC). Die MPN wird aus dem Anteil bestätigter Röhrchen in drei aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen berechnet. Das Kapitel erinnert daran, dass „coliform“ keine taxonomische Kategorie, sondern eine Arbeitsdefinition ist. Was jede Gruppe im Wasser anzeigt, erklärt coliforme Keime, E. coli und Enterokokken.
E. coli in Muscheln: ISO 16649-3
Hier ist die MPN das Verfahren, das die Norm vorgibt. Die Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 legt für lebende Muscheln sowie für lebende Stachelhäuter, Manteltiere und Meeresschnecken ein Lebensmittelsicherheitskriterium für E. coli mit n = 5, c = 1, m = 230 und M = 700 MPN pro 100 g Fleisch und Schalenflüssigkeit fest, das während der gesamten Haltbarkeitsdauer gilt, mit EN/ISO 16649-3 als Referenzmethode. Die Partie ist zufriedenstellend, wenn alle fünf Werte bei 230 oder darunter liegen oder wenn nur einer zwischen 230 und 700 liegt.
Das generische Protokoll des FAO-Referenzzentrums, das auf ISO 16649-3 beruht, beschreibt das Verfahren als zweistufige MPN mit 5 Röhrchen und 3 Verdünnungsstufen. Zuerst wird das Muschelhomogenat in modifizierter Mineral-Glutamat-Bouillon angesetzt und 24 Stunden bei 37 °C bebrütet; anschließend werden die Röhrchen mit Säurebildung auf einen Agar mit chromogenem β-Glucuronidase-Substrat (TBX) bei 44 °C subkultiviert. Die theoretische Nachweisgrenze liegt bei 18 E. coli pro 100 g, und mit drei Verdünnungsstufen ist das höchste berichtbare Ergebnis größer als 18.000. β-Glucuronidase-negative Stämme wie E. coli O157 werden nicht erfasst. Dasselbe Dokument weist darauf hin, dass die Codex-Norm 292-2008 dieses oder ein gleichwertiges Verfahren für lebende oder rohe Muscheln benennt.
Quantitative Salmonella-Bestimmung an Schlachtkörpern und Halshaut
Bei Salmonella beantwortet der Nachweis (Abwesenheit in 25 g), ob der Erreger vorhanden ist; die MPN beantwortet, wie viel davon vorhanden ist. Die Technische Spezifikation ISO/TS 6579-2:2012 beschreibt eine miniaturisierte MPN in 12-Well-Platten: drei Wells pro Verdünnungsstufe, aufeinanderfolgende Verdünnungen in gepuffertem Peptonwasser und Subkultur auf halbfestem MSRV-Medium bei 41,5 °C, mit Bestätigung auf XLD-Agar. Die Norm benennt ihre Grenze: Die Nachweisgrenze liegt bei etwa 1 KBE/g, gegenüber 1 KBE in 25 g (0,04 KBE/g) beim Nachweisverfahren, und sie eignet sich nicht für Proben mit weniger als 1 KBE/g, für die sie eine konventionelle MPN empfiehlt.
Eine 2024 in Poultry Science veröffentlichte Studie wandte diese miniaturisierte MPN auf 96 Sammelproben von Halshaut an, die 480 Hähnchenschlachtkörper repräsentierten. Sie fand Salmonella in 97,9 % der Proben vor der Kühlung und in 85,4 % danach, mit mittleren Keimzahlen von 1,84 bzw. 1,48 log MPN/g. Ein reines Anwesenheitsergebnis hätte diese Verringerung nicht gezeigt. Diese Art der Quantifizierung dient der Bewertung von Prozessschritten, wie Salmonella in Hähnchenfleisch zeigt.
Listeria monocytogenes in positiven Proben
Kapitel 10 des BAM verlangt, L. monocytogenes zu quantifizieren, wenn ein Lebensmittel positiv ausfällt, und zwar mit einer Rückstellportion und einer Kombination aus MPN und Direktausstrich. Die MPN wird mit 50 g Probe in 450 ml gepufferter Listeria-Anreicherungsbouillon (BLEB) und vier Verdünnungsstufen mit je drei Röhrchen angesetzt, entsprechend 10, 1, 0,1 und 0,01 g Probe. Nach 48 Stunden wird jedes Röhrchen zur Isolierung und Bestätigung ausgestrichen oder mit einem zugelassenen Schnellverfahren gescreent, wobei die präsumtiv positiven Röhrchen bestätigt werden; das Ergebnis wird mit den Tabellen aus Anhang 2 ausgewertet. Sind alle Röhrchen positiv, gilt die Zählung aus dem Direktausstrich.
MPN im Vergleich zur Plattenzählung (KBE)
Sie sind keine Konkurrenten, sondern Werkzeuge für unterschiedliche Bereiche und Matrizes:
- Empfindlichkeit bei niedrigen Keimzahlen. Das BAM weist darauf hin, dass die MPN besonders bei niedrigen Konzentrationen unter 100 pro Gramm nützlich ist, vor allem in Milch und Wasser. Jedes Röhrchen kann mehrere Gramm aufnehmen, was die Untergrenze senkt.
- Schwierige Matrizes. Bei Lebensmitteln mit Partikeln, die die Koloniezählung stören, umgeht das Bouillonröhrchen das Problem, Kolonien von Lebensmittelresten zu unterscheiden.
- Wiederbelebung geschädigter Zellen. Die Bouillon wirkt als vorgeschalteter Wachstumsschritt, was durch Hitze, Kälte oder Desinfektionsmittel gestressten Zellen zugutekommt, sofern das Medium geeignet ist.
- Präzision. Das ist die Schwachstelle: Die MPN-Intervalle sind breit, sodass sich zwei scheinbar unterschiedliche Ergebnisse statistisch nicht unterscheiden müssen. Eine korrekt ausgezählte Platte in ihrem Nutzbereich ist in der Regel präziser.
- Aufwand und Zeit. Viele Röhrchen, mehrere Überimpfungen und Bestätigungen von 48 Stunden oder länger. Die traditionelle Kultur auf Platten ist direkter, wenn eine hohe Keimbelastung zu erwarten ist.
- Bestätigung. Bei Pathogenverfahren ist ein Röhrchen mit Wachstum präsumtiv, bis es bestätigt ist (siehe präsumtives vs. bestätigtes Ergebnis).
Welche TAAG-Kits mit diesem Verfahren zusammenhängen
TAAG hat kein MPN-Kit: Seine Real-Time-PCR-Kits sind qualitativ (Nachweis und Identifizierung) und liefern keine Zahl von Mikroorganismen pro Gramm. Eine Rolle können sie beim Auslesen von Röhrchen oder Wells spielen, wie es Kapitel 10 des BAM für die Listeria-MPN zulässt. Im Katalog gibt es Kits für die Mikroorganismen, die per MPN quantifiziert werden: Specio 1.3 E. coli (V-SF167) mit den angegebenen Matrizes Lebensmittel, Getränke sowie belebte und unbelebte Oberflächen; Ampliora 1.3 E. coli (V-SF69) für Blattgemüse und Oberflächen; Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97) mit einer angegebenen Empfindlichkeit von 1 KBE/25 g in rohem Hähnchenschenkel, tiefgekühltem Rindfleisch-Burger, Wurst (Longanicilla), Mortadella und Oberfläche; und Ampliora 2.3 Listeria spp. and L. monocytogenes (V-SF46) für Lebensmittel, Getränke und Oberflächen. Keines gibt Muscheln als validierte Matrix an, und die zugehörigen Anreicherungsmedien sind nicht die Bouillons einer genormten MPN (MMGM, BLEB oder MSRV). Ein Kit zum Auslesen von MPN-Röhrchen einzusetzen erfordert, diese Anwendung mit der konkreten Bouillon und Matrix zu validieren; das sollte vor der Aufnahme in ein Verfahren mit TAAG abgeklärt werden.
Fazit
Die MPN schätzt die Konzentration lebensfähiger Mikroorganismen daraus, wie viele Röhrchen in einer Verdünnungsreihe Wachstum zeigen, gestützt auf eine Poisson-Verteilung und auf Annahmen, die erfüllt sein müssen, damit die Zahl aussagekräftig ist. Ihre Stärke liegt bei niedrigen Keimzahlen, bei Matrizes mit Partikeln und bei Mikroorganismen, die eine Anreicherung benötigen; deshalb ist sie weiterhin die Referenzmethode für E. coli in Muscheln und ein nützliches Werkzeug zur Quantifizierung von Salmonella oder Listeria. Ihr Preis ist die Präzision: Jedes Ergebnis muss mit seinem Konfidenzintervall gelesen werden, und eine Kombination, die nicht in der Tabelle steht, ist ein Warnsignal und keine weitere Zahl. Die Wahl zwischen MPN und Plattenzählung hängt von der erwarteten Keimbelastung, der Matrix und der Entscheidung ab, die mit dem Ergebnis getroffen werden soll.
Über TAAG
Klären Sie mit TAAG, ob Specio 1.3 E. coli oder Ampliora 1.1 Salmonella spp. für das Auslesen der Röhrchen Ihres MPN-Schemas validiert werden können.
Häufig gestellte Fragen
Was ist die wahrscheinlichste Keimzahl (MPN) in der Mikrobiologie?
Sie ist eine statistische Schätzung der Konzentration lebensfähiger Mikroorganismen. Die Probe wird in aufeinanderfolgenden Verdünnungen auf mehrere Bouillonröhrchen verteilt, und je nachdem, wie viele Röhrchen pro Verdünnungsstufe Wachstum zeigen, wird die Konzentration berechnet, die dieses Ergebnis am wahrscheinlichsten erklärt. Angegeben wird sie als MPN pro Gramm, Milliliter oder 100 g, immer mit ihrem Konfidenzintervall.
Worin unterscheiden sich MPN und KBE?
KBE ergeben sich aus dem Zählen von Kolonien auf einer Platte; die MPN ergibt sich aus einer Wahrscheinlichkeitsberechnung über positive und negative Röhrchen. Die MPN ist bei niedrigen Konzentrationen empfindlicher und funktioniert besser bei Matrizes mit Partikeln, ist aber weniger präzise: Ihre Konfidenzintervalle sind breit. Die Plattenzählung ist meist direkter, wenn eine hohe Keimbelastung zu erwarten ist.
Wann sind 5 Röhrchen statt 3 sinnvoll?
Mehr Röhrchen pro Verdünnungsstufe ergeben engere Intervalle und eine niedrigere Untergrenze. Das BAM der FDA verwendet für die meisten Lebensmittel 3 Röhrchen, verlangt bei Muscheln jedoch mindestens 5 Röhrchen pro Verdünnungsstufe. Die Referenzmethode für E. coli in Muscheln, ISO 16649-3, arbeitet mit 5 Röhrchen und 3 Verdünnungsstufen.
Was bedeutet ein Ergebnis wie 3-1-0 oder kleiner als 3 MPN/g?
Der Code gibt an, wie viele Röhrchen in jeder der drei Verdünnungsstufen positiv waren. In der 3-Röhrchen-Tabelle des BAM mit Inokula von 0,1, 0,01 und 0,001 g entspricht 3-1-0 einem Wert von 43 MPN/g (95-%-Intervall: 9 bis 180). Sind alle Röhrchen negativ, wird das Ergebnis als kleiner als 3,0 MPN/g angegeben, nicht als null.
Kann eine PCR eine MPN ersetzen?
Nicht direkt: Eine qualitative PCR beantwortet, ob der Mikroorganismus in der untersuchten Portion vorhanden ist, nicht wie viele es pro Gramm sind. Sie kann jedoch zum Auslesen jedes Röhrchens oder Wells einer MPN eingesetzt werden, wie es das BAM für Listeria zulässt, sofern das Verfahren für diese Bouillon und diese Matrix validiert ist und die positiven Ergebnisse gemäß dem Verfahren bestätigt werden.