Fa parte del pilastro su fondamenti e standardizzazione del Centro di Apprendimento TAAG. Completa la guida sulla certificazione AOAC-PTM e quella sulla coltura microbiologica tradizionale.
Indice dell'articolo
Due domande diverse sullo stesso metodo
Prima di usare un metodo microbiologico in routine, un laboratorio deve rispondere a due domande. La prima è se il metodo funziona: se rileva o quantifica il microrganismo bersaglio con una prestazione accettabile rispetto a un riferimento riconosciuto. La seconda è se funziona nelle sue mani, con il suo personale, le sue apparecchiature e gli alimenti che analizza ogni giorno. Alla prima domanda risponde la validazione; alla seconda, la verifica.
La distinzione non è un tecnicismo. La norma ISO/IEC 17025:2017, che disciplina la competenza dei laboratori di prova, richiede che il laboratorio verifichi di saper applicare correttamente un metodo prima di introdurlo, dimostrando di raggiungere la prestazione richiesta e conservando le registrazioni. Un metodo validato che nessuno ha verificato nel laboratorio che lo usa lascia un vuoto che emerge spesso negli audit. I requisiti di accreditamento sono sviluppati nell'articolo su ISO/IEC 17025 nei laboratori alimentari.
Validazione: stabilire la prestazione del metodo
La validazione consiste nel determinare le caratteristiche prestazionali di un metodo e nel fornire evidenza oggettiva che soddisfi i requisiti per un uso previsto. In microbiologia degli alimenti ciò significa, quasi sempre, confrontare un metodo alternativo (ad esempio un kit PCR o un terreno cromogeno) con un metodo di riferimento, che di solito è un protocollo di coltura tradizionale normalizzato come la ISO 6579-1 per Salmonella.
La serie ISO 16140
Il comitato tecnico ISO/TC 34/SC 9 ha sostituito la vecchia ISO 16140:2003 con una serie di norme, ciascuna pensata per uno scenario diverso:
- ISO 16140-1:2016: vocabolario comune della validazione.
- ISO 16140-2:2016: protocollo per validare metodi alternativi, in prevalenza commerciali, rispetto a un metodo di riferimento. Ha un emendamento pubblicato nel 2024 che ha rivisto parte dei calcoli.
- ISO 16140-3:2021: protocollo per verificare, in un singolo laboratorio, metodi di riferimento e metodi alternativi già validati.
- ISO 16140-4: validazione in un singolo laboratorio. I suoi risultati sono validi solo per il laboratorio che ha condotto lo studio.
- ISO 16140-5: validazione interlaboratorio fattoriale per metodi non commerciali, con meno laboratori partecipanti rispetto alla parte 2.
- ISO 16140-6:2019: validazione di metodi alternativi di conferma e tipizzazione, che partono da una colonia sospetta e non da un campione di alimento.
La serie è completata dalla ISO 17468, che fissa i requisiti tecnici per stabilire o rivedere un metodo di riferimento normalizzato.
Cosa comprende una validazione secondo la ISO 16140-2
Il protocollo ha due fasi. La prima è uno studio comparativo condotto in un laboratorio organizzatore: si analizzano campioni contaminati con entrambi i metodi per misurare la sensibilità, si determina il livello di rilevamento relativo (RLOD) e si verificano inclusività ed esclusività con 50 ceppi del microrganismo bersaglio e 30 ceppi non bersaglio. Nei metodi quantitativi, lo studio comparativo valuta la veridicità relativa e il profilo di accuratezza. La seconda fase è uno studio interlaboratorio, in cui più laboratori analizzano gli stessi campioni per stimare la riproducibilità del metodo.
Il campo di applicazione della validazione dipende dalle categorie di alimenti studiate. Per dichiarare un metodo valido per un'"ampia gamma di alimenti" devono essere coperte almeno cinque categorie. Questa dichiarazione del campo di applicazione è la prima cosa da controllare in un certificato.
Chi certifica
In Europa, organismi indipendenti come MicroVal, NF Validation (AFNOR) e NordVal (NMKL) emettono certificati basati sulla ISO 16140-2 e pubblicano i rapporti sui propri siti. Negli Stati Uniti lo schema più diffuso è quello di AOAC International, che spieghiamo nella guida sulla certificazione AOAC-PTM.
Cosa dice la normativa europea
Il Regolamento (CE) 2073/2005 stabilisce all'articolo 5 che i metodi analitici dell'allegato I sono quelli di riferimento, e che l'uso di metodi alternativi è accettabile quando sono validati rispetto a tale riferimento e, se commerciali, certificati da una terza parte secondo il protocollo della EN ISO 16140 o altri protocolli simili accettati a livello internazionale. Il Regolamento (UE) 2019/229 ha aggiunto definizioni chiave: cosa si intende per "ampia gamma di alimenti" e che cos'è un organismo di certificazione indipendente dal produttore del metodo.
Verifica: dimostrare che il metodo funziona nel tuo laboratorio
La ISO 16140-3 definisce la verifica come la dimostrazione che un metodo validato funziona nelle mani dell'utilizzatore secondo le specifiche della sua validazione. Divide il processo in due fasi.
Fase 1: verifica dell'implementazione
Il laboratorio dimostra di saper eseguire il metodo usando un solo alimento, scelto tra quelli analizzati nello studio di validazione. Se i risultati sono simili a quelli della validazione, il problema di fondo (la tecnica) è risolto.
Fase 2: verifica degli alimenti del laboratorio
Poi il laboratorio dimostra che il metodo funziona con gli alimenti che dichiara di analizzare. A tal fine sceglie un alimento "difficile" per ciascuna categoria inclusa nel proprio campo di applicazione: prodotti con bassa attività dell'acqua, con antimicrobici naturali come le spezie, con lecitina, con molto grasso. La guida di formazione dello stesso comitato ISO mostra esempi come gelato, uovo in polvere, carne condita e cacao in polvere.
Cosa si misura e con quale criterio di accettazione
Metodi qualitativi: eLOD50
Nei metodi di rilevamento si stima il livello di rilevamento al 50 % (eLOD50): la contaminazione alla quale il metodo dà esito positivo nella metà delle porzioni analizzate. Si chiama "stimato" perché il numero di campioni è molto inferiore a quello di una validazione completa. Il criterio di accettazione è che l'eLOD50 ottenuto non superi di quattro volte il LOD50 della validazione. Nell'esempio della guida di formazione ISO per Salmonella secondo la ISO 6579-1, il LOD50 di riferimento era di 5,7 UFC, il limite era 22,8 UFC e il laboratorio ha ottenuto 3,0 UFC, quindi era conforme. Il concetto di LOD50 è sviluppato nell'articolo sul limite di rilevamento e incertezza di misura.
Metodi quantitativi: riproducibilità e bias
Nelle conte, la verifica dell'implementazione misura la deviazione standard di riproducibilità intralaboratorio (SIR), con un disegno allineato alla ISO 19036. Il criterio è che non superi il doppio del valore medio di riproducibilità più basso ottenuto nella validazione. La verifica degli alimenti misura il bias stimato (eBias): si contaminano porzioni a tre livelli, in duplicato, e la differenza rispetto al livello atteso non deve superare 0,5 log10 in nessun livello.
Metodi di conferma e tipizzazione
Qui si richiede solo la verifica dell'implementazione: si testano ceppi bersaglio e non bersaglio (nell'esempio della guida, cinque per tipo) e si richiede una concordanza del 100 % con il risultato atteso.
La scadenza del 2028 per i metodi di riferimento non validati
Molte norme ISO di riferimento sono state pubblicate senza dati prestazionali. Per esse, la ISO 16140-3 offre un protocollo transitorio nell'allegato F. Secondo il documento di transizione del comitato ISO, tale allegato può essere usato fino al 31 dicembre 2027; dal 1° gennaio 2028 solo i metodi di riferimento validati potranno essere verificati ai sensi della ISO 16140-3. Le norme ISO sono volontarie, ma gli organismi di accreditamento le assumono di solito come criterio.
Lo stesso documento chiarisce quando occorre verificare di nuovo. Un metodo già accreditato non necessita di una nuova verifica a meno che non cambi. Un metodo nuovo o una nuova categoria di alimenti all'interno del campo di applicazione la richiedono. Anche se un metodo validato subisce una modifica tecnica rilevante con impatto significativo.
Se la verifica non è conforme
La norma richiede un'analisi delle cause radice prima di ripetere. Le cause abituali sono la preparazione e il livello dell'inoculo, l'omogeneizzazione del campione, la taratura delle apparecchiature, i lotti di terreni o reagenti e l'applicazione del protocollo da parte dell'analista. Se il problema persiste, il passo successivo è consultare il fornitore del metodo (se commerciale), l'organismo di normazione (se di riferimento) o l'organismo di certificazione.
Errori comuni
- Dare per scontato che un certificato di validazione sostituisca la verifica nel laboratorio.
- Applicare il metodo ad alimenti di una categoria che non rientra nel campo di applicazione della sua validazione.
- Verificare solo con un alimento "facile" e non con uno rappresentativo delle difficoltà reali del laboratorio.
- Non conservare le registrazioni di verifica, che sono esigibili ai sensi della ISO/IEC 17025.
- Modificare una fase del protocollo, come il tempo di arricchimento, e continuare a trattare il metodo come validato.
Conclusione
Validare e verificare rispondono a domande diverse: se un metodo funziona e se funziona nel tuo laboratorio. La serie ISO 16140 ordina entrambi i processi, dalla validazione di metodi alternativi secondo la ISO 16140-2 alla verifica in un singolo laboratorio secondo la ISO 16140-3, con criteri di accettazione concreti come l'eLOD50 o l'eBias. Controllare il campo di applicazione del certificato, verificare con alimenti rappresentativi e conservare le registrazioni evita che un metodo ben validato diventi un punto debole del laboratorio.
Informazioni su TAAG
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Domande frequenti
Qual è la differenza tra validare e verificare un metodo microbiologico?
La validazione stabilisce la prestazione del metodo e dimostra che serve per un uso previsto, normalmente confrontandolo con un metodo di riferimento. La verifica dimostra che un laboratorio specifico ottiene tale prestazione applicandolo con le proprie apparecchiature, il proprio personale e i propri alimenti.
Un metodo con certificato MicroVal, NF Validation o AOAC deve essere verificato?
Sì. Il certificato avalla il metodo, ma la ISO/IEC 17025 richiede che ogni laboratorio verifichi di saperlo applicare correttamente prima di usarlo, e la ISO 16140-3 descrive come farlo.
Che cos'è l'eLOD50?
È il livello di rilevamento al 50 % stimato durante la verifica di un metodo qualitativo: la contaminazione alla quale il metodo rileva il microrganismo nella metà delle porzioni analizzate. La ISO 16140-3 accetta il risultato se non supera di quattro volte il LOD50 ottenuto nella validazione.
Cosa succede con i metodi di riferimento ISO privi di dati di validazione?
Fino al 31 dicembre 2027 possono essere verificati con il protocollo transitorio dell'allegato F della ISO 16140-3. Dal 1° gennaio 2028 solo i metodi di riferimento validati potranno essere verificati secondo tale norma.