Fa parte del pilastro sui metodi di laboratorio del Centro di Apprendimento TAAG, insieme all'arricchimento microbiologico.
Indice dell'articolo
Un positivo non è sempre un risultato finale
In un rapporto di laboratorio, "positivo" può significare due cose diverse. Può essere un risultato presuntivo: la prova ha dato un segnale compatibile con il microrganismo cercato, ma la sua identità non è ancora stata dimostrata. Oppure può essere un risultato confermato: il microrganismo è stato isolato e si è verificato, con prove aggiuntive, che è davvero il bersaglio dell'analisi. Confondere i due porta a decisioni affrettate in un senso o nell'altro: rilasciare prodotto che doveva essere trattenuto o distruggere un lotto per un risultato che non reggeva.
Questo articolo percorre quel tratto dell'analisi, dallo screening alla conferma, prendendo come riferimento il Bacteriological Analytical Manual (BAM) della FDA per Salmonella e la serie di norme ISO 16140, che definisce come si validano i metodi alternativi rispetto a quelli di riferimento.
Da dove nasce un risultato presuntivo
Nella coltura tradizionale
Nella coltura microbiologica tradizionale, una colonia con la morfologia tipica su un terreno selettivo è un riscontro presuntivo. Il capitolo 5 del BAM descrive la sequenza per Salmonella: preparazione e pre-arricchimento il primo giorno, arricchimento selettivo il secondo, semina su piastre selettive il terzo, screening biochimico il quarto e conferma il quinto. Lo stesso manuale indica che il metodo colturale richiede da 4 a 5 giorni per arrivare a un risultato presuntivo.
Nei metodi molecolari di screening
La PCR e altri metodi rapidi si usano di solito come screening. L'edizione del BAM di gennaio 2026 include una sezione, aggiunta a maggio 2024, con metodi qPCR e LAMP sviluppati dalla FDA che si applicano alla coltura di pre-arricchimento di 24 ore, cioè il secondo giorno. La regola fissata dal manuale è chiara: i campioni con screening negativo si riportano come negativi e non richiedono ulteriori analisi colturali; i campioni con screening positivo devono essere confermati per coltura seguendo le procedure di isolamento e identificazione.
Questa asimmetria spiega il valore dello screening. La maggior parte dei campioni di routine è negativa, e per essi il risultato arriva giorni prima. Solo quelli positivi percorrono la strada lunga.
Cosa dice la ISO 16140-2 sulla conferma
La ISO 16140-2:2016 è il protocollo di validazione dei metodi alternativi (in genere commerciali) rispetto a un metodo di riferimento. La norma parte da un'idea utile per il lavoro quotidiano: molti metodi alternativi hanno due passaggi, prima l'arricchimento e il rilevamento, poi la conferma di quel risultato. Il risultato finale del metodo è quello che esce dal secondo passaggio.
Durante la validazione, la norma richiede di confermare i positivi del metodo alternativo che non coincidono con il metodo di riferimento, perché tale conferma permette di sapere se si tratta di un vero o di un falso positivo. La conferma deve essere in grado di recuperare l'isolato e di dimostrarne l'identità, e può basarsi sulla procedura del metodo di riferimento, sul passaggio di conferma del metodo alternativo stesso, su una combinazione di entrambi o su qualsiasi altro mezzo che riesca a isolare e identificare il microrganismo.
C'è un dettaglio tecnico con conseguenze pratiche. Se l'arricchimento del metodo alternativo è diverso da quello di riferimento (meno fasi o meno ore di incubazione), la norma richiede una seconda via di conferma: derivare parte dell'arricchimento del metodo alternativo verso lo schema del metodo di riferimento, rispettando almeno il suo tempo totale di incubazione. In altre parole, un arricchimento breve può bastare per rilevare un segnale molecolare, ma non necessariamente per recuperare una colonia su piastra.
Questa norma ha peso normativo. Nell'Unione europea, il Regolamento (UE) 2019/229 ha modificato l'articolo 5 del Regolamento (CE) 2073/2005 per richiedere che i metodi alternativi siano validati rispetto al metodo di riferimento dell'allegato I conformemente alla EN ISO 16140-2, e che i metodi registrati siano certificati da un organismo indipendente. In pratica, la validazione e la certificazione AOAC-PTM o ISO 16140 di un metodo comprendono il suo protocollo di conferma.
Come si conferma oggi
Biochimica e sierologia
La via classica combina prove biochimiche, che valutano quali substrati metabolizza l'isolato, con la sierologia, che identifica gli antigeni di superficie. Per Salmonella, il BAM richiede che la conferma sierologica, con gli antigeni somatici (O) e flagellari (H), sia sempre accompagnata da conferma biochimica. Consente di sostituire la batteria di provette convenzionale con sistemi come API 20E, Enterotube II o Vitek 2 GN, ma avverte che i kit biochimici commerciali non sostituiscono la sierologia.
Metodi strumentali e molecolari sull'isolato
Il BAM accetta inoltre come conferma di isolati presuntivi una qPCR e un LAMP sviluppati dalla FDA, un metodo di amplificazione isotermica (AOAC OMA 2013.14) e l'identificazione tramite spettrometria di massa MALDI-TOF (AOAC OMA 2017.09), oltre ad altri metodi validati secondo le linee guida della FDA, l'Appendice J di AOAC o la ISO 16140-6:2019. Un isolato si riporta come Salmonella se lo confermano insieme sierologia e biochimica, o uno dei metodi strumentali accettati. Se le conferme si contraddicono, si ricorre a prove aggiuntive o a un laboratorio di riferimento per la tipizzazione definitiva.
ISO 16140-6: validare il metodo di conferma stesso
La ISO 16140-6:2019 copre la validazione di metodi alternativi di conferma e di tipizzazione. Confronta il metodo alternativo con la procedura di conferma del metodo di riferimento o, quando serve, con un metodo di conferma di riferimento come il sequenziamento genomico completo (WGS). Si applica anche alla tipizzazione, ad esempio la sierotipizzazione di Salmonella o la tipizzazione molecolare di STEC.
Perché un presuntivo può non essere confermato
Un positivo di screening che non si conferma non significa automaticamente che la prova "abbia sbagliato". Le cause possibili sono diverse ed è bene distinguerle:
- Materiale genetico senza cellula vitale: un metodo basato sul DNA può rilevare residui di cellule inattivate da un trattamento termico o da un sanificante, un limite che spieghiamo in RNA vs. DNA. In tal caso non c'è nulla di vivo da isolare.
- Reattività crociata: un organismo non bersaglio che condivide parte della sequenza cercata. È ciò che valuta lo studio di esclusività durante la validazione del metodo.
- Difficoltà nel recuperare l'isolato: cellule stressate, un microbiota di accompagnamento che compete nell'arricchimento o livelli molto bassi possono impedire di ottenere la colonia anche se il patogeno era presente. Per questo la ISO 16140-2 prevede la seconda via di conferma quando gli arricchimenti differiscono.
- Contaminazione in laboratorio: un trascinamento di materiale amplificato o di un controllo positivo. I controlli di ogni seduta, che sviluppiamo in controlli di una PCR, esistono per individuarlo.
Cosa fare in attesa della conferma
La conferma è un passaggio analitico, ma la decisione sul prodotto spetta allo stabilimento. Alcuni criteri ragionevoli:
- Prodotto finito: un lotto con risultato presuntivo positivo viene trattenuto fino alla conferma. Rilasciare un lotto "perché non è ancora confermato" capovolge la logica dello screening.
- Ambiente: in un programma di monitoraggio ambientale, molti stabilimenti trattano il presuntivo come un segnale per agire subito (pulizia rinforzata, campionamento dei vettori attorno al punto positivo) senza attendere la conferma, perché il costo di reagire in ritardo è maggiore.
- Tracciabilità dell'isolato: se il risultato viene confermato, conservare l'isolato permette di tipizzarlo in seguito e di confrontarlo con riscontri precedenti dello stesso stabilimento.
Ciò che non conviene è riportare come definitivo un presuntivo, né scartare un presuntivo non confermato senza capire perché non si è confermato. Entrambe sono decisioni di laboratorio che devono essere scritte nella procedura prima che arrivi il primo positivo.
Conclusione
Un risultato presuntivo è un segnale che non ha ancora dimostrato l'identità del microrganismo, e un confermato è un isolato identificato con prove aggiuntive. Il BAM della FDA richiede di confermare per coltura i positivi di screening, la ISO 16140-2 integra la conferma nella validazione dei metodi alternativi e la ISO 16140-6 permette di validare metodi più rapidi per quel passaggio. Tra i due momenti decide lo stabilimento: trattenere il prodotto, agire sull'ambiente e lasciare scritto cosa si fa quando un presuntivo non si conferma.
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Domande frequenti
Un positivo in PCR è un risultato definitivo?
Nella maggior parte degli schemi, no. Il BAM della FDA stabilisce che i campioni con screening positivo in qPCR o LAMP devono essere confermati per coltura, mentre quelli negativi si riportano come negativi senza ulteriori analisi.
Quanto tempo richiede la conferma di Salmonella per coltura?
Il BAM descrive un flusso di cinque giorni: pre-arricchimento, arricchimento selettivo, semina su piastre, screening biochimico e conferma. Lo stesso manuale indica che il metodo colturale richiede da 4 a 5 giorni per arrivare a un risultato presuntivo.
Si può confermare con MALDI-TOF o PCR al posto della sierologia?
Sì, sull'isolato. Il BAM accetta, tra gli altri, una qPCR e un LAMP della FDA e l'identificazione tramite MALDI-TOF (AOAC OMA 2017.09). La ISO 16140-6:2019 definisce come validare questi metodi alternativi di conferma.
Cosa significa che un presuntivo non si conferma?
Può trattarsi di un falso positivo, ma anche di DNA di cellule non vitali, di un isolato difficile da recuperare o di una contaminazione in laboratorio. Per questo conviene indagare la causa prima di scartare il risultato.