Parte del pilastro su fondamenti e standardizzazione del Centro di Apprendimento TAAG. Approfondisce un punto che abbiamo menzionato in l'accreditamento ISO/IEC 17025 e si basa sulla coltura microbiologica tradizionale.
Indice dell'articolo
Anche il terreno di coltura va analizzato
Quando un laboratorio riporta "Salmonella: non rilevata" o una conta di Enterobatteri, dà per scontato che il terreno su cui ha seminato funzionasse. Se un lotto di agar selettivo inibisce anche il microrganismo ricercato, oppure lascia crescere la flora di accompagnamento che avrebbe dovuto sopprimere, il risultato è sbagliato anche se l'analista ha fatto tutto correttamente. Per questo la microbiologia degli alimenti dispone di una norma dedicata esclusivamente ai terreni: ISO 11133.
La sua introduzione riassume l'obiettivo in tre idee: dimostrare che ogni lotto di terreno è accettabile, che il terreno è idoneo all'uso previsto e che produce risultati coerenti. Sono, afferma la stessa norma, parte essenziale del controllo di qualità interno del laboratorio.
Che cos'è ISO 11133 e a chi si applica
L'edizione vigente, ISO 11133:2014, ha sostituito le specifiche tecniche ISO/TS 11133-1:2009 e ISO/TS 11133-2:2003 e ha incorporato i terreni per l'analisi dell'acqua. Definisce i termini dell'assicurazione di qualità dei terreni, fissa i requisiti per prepararli e descrive metodi e criteri per valutarne le prestazioni. Copre i terreni usati per analizzare alimenti, mangimi, campioni dell'ambiente di produzione e acque destinate al consumo o all'uso nella produzione alimentare.
Si applica a chi produce o distribuisce terreni disidratati o pronti all'uso, a organismi non commerciali che li forniscono a terzi e ai laboratori che preparano i propri terreni. L'emendamento 1 del 2018 ha aggiunto espressamente gli utilizzatori finali di terreni pronti all'uso: acquistare piastre già preparate non esonera il laboratorio dal controllarle.
Due emendamenti e una nuova edizione in arrivo
- Emendamento 1 (2018): correzioni e chiarimenti, tra cui i livelli di inoculo per le prove di prestazione.
- Emendamento 2 (2020): ha aggiunto l'allegato K, con i ceppi di controllo per terreni e reagenti di conferma e caratterizzazione.
- Seconda edizione: il progetto ISO/FDIS 11133, che cambia titolo in "terreni di coltura e reagenti", è nella fase finale di votazione in ISO e sostituirà l'edizione del 2014 quando sarà pubblicato.
Il comitato ISO/TC 34/SC 9 precisa inoltre che le norme per singolo microrganismo pubblicate dopo il 2014 che includono una propria sezione di prove di prestazione prevalgono su quanto indicato da ISO 11133:2014 per quei terreni.
Le tre proprietà valutate
Produttività
È il livello di recupero del microrganismo bersaglio nel terreno in condizioni definite. Risponde alla domanda più elementare: se il microrganismo è presente, il terreno gli permette di crescere?
Selettività
È il grado di inibizione di un microrganismo non bersaglio in un terreno selettivo. Un agar per Salmonella che lascia crescere liberamente Escherichia coli produce piastre sature in cui le colonie tipiche vanno perse.
Specificità (elettività)
È la dimostrazione che i microrganismi non bersaglio, se riescono a crescere, non mostrano le stesse caratteristiche visive del bersaglio: il colore, l'alone o la morfologia che l'analista usa per riconoscere una colonia sospetta. Nei terreni cromogenici è la proprietà che evita di confondere una colonia con un'altra.
Come si eseguono le prove
Prova quantitativa e rapporto di produttività
Per i terreni solidi di conta, la norma confronta la crescita nel terreno in esame con quella di un terreno di riferimento, normalmente non selettivo, come l'agar triptone soia (TSA). Il risultato è il rapporto di produttività, PR = NS/N0: la conta nel terreno in esame divisa per la conta nel terreno di riferimento. L'emendamento 1 fissa l'inoculo a circa 100 UFC per ottenere una precisione sufficiente, con un intervallo pratico da 80 a 120 UFC per piastra e un minimo di 50.
Il criterio abituale è un PR di almeno 0,5 per i terreni selettivi e di almeno 0,7 per quelli non selettivi. Un esempio concreto della norma: l'agar TBX per E. coli β-glucuronidasi positivo si testa con ceppi di E. coli, si confronta con il TSA e deve dare PR ≥ 0,5 con colonie blu.
Prove qualitative
Nei terreni liquidi e in alcuni solidi il risultato si esprime su una scala semplice: 0 (nessuna crescita o nessuna torbidità), 1 (crescita debole) e 2 (buona crescita). Per la selettività, l'emendamento 1 richiede di inoculare almeno 104 UFC del microrganismo non bersaglio; per la specificità su piastra, almeno 103 UFC.
Brodi di arricchimento selettivo
I brodi come l'RVS per Salmonella si testano inoculando il bersaglio, il non bersaglio o una miscela di entrambi, e poi strisciando su un terreno di isolamento (ad esempio XLD) e su un terreno non selettivo. La selettività del brodo è considerata soddisfacente se sulla piastra non selettiva non c'è crescita del non bersaglio, oppure ce ne sono meno di 10 o meno di 100 UFC, secondo quanto indicato dall'allegato corrispondente o dalla norma specifica. È lo stesso principio che decide il successo dell'arricchimento microbiologico su un campione reale.
Terreni multiuso e di conferma
Per un terreno con più usi, come l'acqua peptonata tamponata (BPW), l'emendamento 1 richiede come minimo una prova di preenrichment con un patogeno pertinente per il laboratorio, ad esempio Salmonella. Nei terreni e nei reagenti di conferma (allegato K), la prova è qualitativa perché si parte da una colonia isolata: il controllo positivo viene incubato per il tempo minimo consentito dalla norma e quello negativo per il massimo. In questo modo si verifica che il positivo compaia in tempo e che il negativo non viri per eccesso di incubazione. La conferma delle colonie sospette è spiegata nell'articolo su risultato presunto e confermato.
Ceppi di controllo: perché conta il numero WDCM
Una prova di prestazione è confrontabile tra laboratori solo se tutti usano ceppi equivalenti. ISO 11133 definisce una catena precisa:
- Ceppo di riferimento: ottenuto direttamente da una collezione membro della World Federation for Culture Collections (WFCC) o dell'organizzazione europea ECCO, identificato almeno a livello di genere e specie.
- Stock di riferimento: colture identiche ottenute da un'unica sottocoltura del ceppo di riferimento.
- Coltura stock: sottocoltura primaria dello stock di riferimento.
- Coltura di lavoro: quella usata nella prova, ottenuta dallo stock di riferimento, dalla coltura stock o da un materiale di riferimento.
Ogni collezione numera i propri ceppi a modo suo, quindi lo stesso ceppo ha codici diversi in ciascun catalogo. Il World Data Centre for Microorganisms (WDCM) ha risolto il problema con un identificativo univoco: il catalogo dei ceppi di riferimento WDCM. Ad esempio, WDCM 00031 corrisponde a Salmonella Typhimurium NCTC 12023 nella collezione britannica.
Un esempio dall'elenco ufficiale
Il comitato ISO/TC 34/SC 9 pubblica un elenco di ceppi di controllo per ogni terreno e reagente delle sue norme; la quarta edizione è del maggio 2025. Per l'agar XLD della ISO 6579-1, l'elenco indica Salmonella Enteritidis WDCM 00030 o Typhimurium WDCM 00031, E. coli WDCM 00012 o 00013 ed Enterococcus faecalis WDCM 00009 o 00087. Una nota avverte che alcune normative nazionali possono richiedere un altro sierotipo di Salmonella, e un'altra segna con la lettera "b" i ceppi da usare come minimo.
Oltre la prova microbiologica
Il controllo di un terreno inizia prima della semina. ISO 11133 richiede che il produttore documenti, tra gli altri dati, il nome e i componenti del terreno, la scheda tecnica, il numero di lotto, il pH obiettivo del terreno completo, le condizioni di conservazione e la scadenza. Il laboratorio che prepara terreni propri deve inoltre curare l'acqua, la pesata, la sterilizzazione, il pH finale e la conservazione; ISO 7218:2024 completa questi requisiti generali per il laboratorio di microbiologia.
Tutto questo si inserisce in ISO/IEC 17025, che impone di garantire l'idoneità dei prodotti forniti dall'esterno e di vigilare sulla validità dei risultati. Un lotto che non supera il controllo è un lavoro non conforme: occorre valutare quali analisi possano essere state compromesse, come si commenta nell'articolo sull'accreditamento ISO/IEC 17025. Nei metodi molecolari la logica è la stessa, con controlli propri, spiegati nell'articolo sui controlli di una PCR.
Errori comuni
- Accettare il certificato del fornitore come unico controllo, senza verificare il lotto in laboratorio.
- Usare ceppi di collezione sottocoltivati senza registrazione, senza poterne risalire all'origine fino al ceppo di riferimento.
- Testare la produttività con inoculi molto alti, che nascondono un'inibizione parziale del terreno.
- Controllare la produttività e dimenticare la selettività o la specificità nei terreni selettivi e cromogenici.
- Non tenere conto che la norma specifica del microrganismo può fissare ceppi e criteri propri che prevalgono su ISO 11133.
Conclusione
Un terreno di coltura è un reagente con prestazioni misurabili, non un materiale neutro. ISO 11133 stabilisce come dimostrarlo: produttività rispetto a un terreno di riferimento, selettività con inoculi elevati di non bersaglio, specificità nei terreni differenziali e ceppi di controllo tracciabili tramite i numeri WDCM. Controllare ogni lotto, registrare la catena delle sottocolture e verificare che cosa richiede la norma di ciascun microrganismo evita che un risultato dipenda da un lotto difettoso senza che nessuno lo sappia.
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Domande frequenti
Che cos'è ISO 11133?
È la norma internazionale che definisce come preparare, produrre, conservare e controllare le prestazioni dei terreni di coltura usati nella microbiologia di alimenti, mangimi, ambiente di produzione e acqua. L'edizione vigente è del 2014, con emendamenti del 2018 e del 2020.
Qual è la differenza tra produttività, selettività e specificità di un terreno?
La produttività misura quanto il terreno recupera del microrganismo bersaglio. La selettività misura quanto inibisce i non bersaglio. La specificità dimostra che i non bersaglio che crescono non si confondono visivamente con il bersaglio.
Che cos'è un numero WDCM?
È un identificativo univoco assegnato dal World Data Centre for Microorganisms ai ceppi raccomandati per il controllo di qualità. Permette di sapere che ceppi con codici diversi in collezioni diverse sono, in realtà, lo stesso.
Un laboratorio che acquista piastre pronte all'uso deve controllarle?
Sì. L'emendamento 1 del 2018 ha incluso espressamente gli utilizzatori finali di terreni pronti all'uso nel campo di applicazione di ISO 11133, e ISO/IEC 17025 richiede di verificare l'idoneità dei materiali forniti dall'esterno.