Fa parte del pilastro su fondamenti e standardizzazione del Centro di Apprendimento TAAG. Approfondisce quanto visto su come si interpretano le UFC e sulla fase di arricchimento microbiologico.
Indice dell'articolo
Un risultato microbiologico porta sempre con sé un margine
Un rapporto dice "Salmonella: non rilevata in 25 g" oppure "aerobi mesofili: 1,2 × 105 UFC/g". Entrambi i risultati sembrano definitivi, ma nessuno dei due lo è del tutto. Il primo dipende dalla probabilità che il metodo rilevi le poche cellule che potrebbero esserci nella porzione analizzata. Il secondo è una stima con una dispersione che, in microbiologia, è molto maggiore rispetto a un'analisi chimica. Capire questi margini è ciò che permette di decidere bene quando un risultato cade vicino a un limite.
Perché la microbiologia è diversa
I batteri non si distribuiscono in un alimento come una sostanza disciolta. Sono particelle discrete, spesso aggregate, e quando sono a bassa concentrazione la loro presenza in una porzione di prova è questione di caso. Se un lotto ha in media una cellula di Salmonella ogni 25 g, alcune porzioni da 25 g non ne avranno nessuna, altre ne avranno una e altre due o più. Questa distribuzione casuale segue una distribuzione di Poisson e fissa un limite teorico che nessun metodo può superare.
Il tetto teorico di qualsiasi metodo
Con una distribuzione di Poisson, la probabilità che una porzione contenga almeno una cellula è 1 − e−λ, dove λ è il numero medio di cellule per porzione. Con una media di 1 UFC per porzione, tale probabilità è di circa il 63 %: anche un metodo perfetto fallirebbe in più di un terzo dei casi, semplicemente perché la cellula non è nella porzione. Per raggiungere il 50 % di rilevamento basta una media di ln 2, circa 0,69 UFC per porzione; per arrivare al 95 % servono circa 3 UFC per porzione.
Metodi qualitativi: dal LOD al LOD50
In un metodo di rilevamento (presenza o assenza), il limite di rilevamento non si esprime come un numero fisso, ma come una curva di probabilità di rilevamento (POD) in funzione della contaminazione. Wilrich e Wilrich hanno descritto nel 2009, sul Journal of AOAC International, un modello statistico per stimare tale curva e il LODp, la contaminazione che il metodo rileva con una probabilità p. Il valore più usato è il LOD50: la concentrazione alla quale il metodo dà esito positivo nella metà delle porzioni analizzate.
Il LOD50 permette di confrontare i metodi tra loro e con il tetto teorico. La ISO 16140-2 lo usa per calcolare il livello di rilevamento relativo (RLOD) tra un metodo alternativo e quello di riferimento, e la ISO 16140-3 chiede a ciascun laboratorio di stimare il proprio eLOD50 quando verifica un metodo e di controllare che non superi di quattro volte quello della validazione. La procedura è spiegata nell'articolo sulla validazione e verifica dei metodi.
Cosa significa "assenza in 25 g"
Un risultato negativo significa che il metodo non ha rilevato il microrganismo in quella porzione, non che il lotto ne sia privo. Per questo i criteri di assenza si applicano su più unità campionarie, e per questo la fase di arricchimento conta tanto: è quella che permette a una sola cellula, spesso danneggiata, di moltiplicarsi fino a livelli rilevabili. Quante unità analizzare e quale probabilità di rilevare un lotto contaminato offra ciascun piano è sviluppato nell'articolo sui piani di campionamento per attributi.
Metodi quantitativi: il limite di quantificazione
In una conta su piastra, il limite inferiore è fissato dalla minore diluizione seminata. Se si semina 1 mL della diluizione 10−1 e non cresce nessuna colonia, il risultato non è "0 UFC/g", ma "minore di 10 UFC/g" (nell'esempio della guida della ISO 19036, con due diluizioni senza colonie, il limite calcolato è di 9,1 UFC/g). Riportare "0" è uno degli errori di interpretazione già commentati nell'articolo sulle UFC.
Incertezza di misura nelle conte: ISO 19036:2019
La ISO/IEC 17025 richiede ai laboratori accreditati di valutare l'incertezza di misura delle proprie prove. Per le conte di microbiologia degli alimenti, il riferimento è la ISO 19036:2019, pubblicata nell'ottobre 2019 come revisione della specifica tecnica del 2006. La presentazione del gruppo di lavoro ISO ricorda che i risultati quantitativi in microbiologia sono molto variabili, dell'ordine di 0,1-1 log10.
Le tre componenti
- Incertezza tecnica: la variabilità delle fasi dell'analisi (pesata, diluizioni, semina, incubazione, conta, conferma, lotti di terreni, analisti). Si stima preferibilmente come deviazione standard di riproducibilità intralaboratorio (sIR), analizzando almeno 10 campioni con due risultati ciascuno in condizioni che varino quanto in routine. Di solito è la componente maggiore.
- Incertezza di matrice: in che misura la porzione di prova non rappresenta il campione di laboratorio. Per i liquidi o per campioni ben omogeneizzati si può usare un valore fisso di 0,1 log10; negli alimenti solidi o a più componenti può essere molto maggiore.
- Incertezza distribuzionale: la variazione casuale di Poisson. Si calcola a partire dal totale delle colonie contate (0,4343/√ΣC in log10) e pesa soprattutto quando si contano poche colonie.
Incertezza estesa e come si riporta
Le componenti si combinano come radice quadrata della somma dei loro quadrati, e il risultato si moltiplica per un fattore di copertura k = 2, che corrisponde approssimativamente a un livello di confidenza del 95 %. La norma ammette anche un'opzione semplificata, usare solo la riproducibilità, avvertendo che può sottostimare l'incertezza negli alimenti solidi o a livelli bassi.
L'esempio della guida ISO lo mostra bene: una conta di 1,00 × 105 UFC/g, con un'incertezza estesa di 0,31 log10, si riporta come 5,00 ± 0,31 log10 UFC/g. In valori naturali, l'intervallo va da 4,90 × 104 a 2,04 × 105 UFC/g: più del doppio tra un estremo e l'altro.
Ciò che l'incertezza di misura non include
La ISO 19036 lascia fuori due fonti di errore. La prima è l'incertezza di campionamento, l'errore di prelevare il campione di laboratorio dal lotto, che può essere grande ma non è attribuita al laboratorio. La seconda è il bias: in microbiologia degli alimenti non esiste un valore "vero" indipendente dal metodo con cui confrontare un risultato di routine.
Dal numero alla decisione
Immagina una conta di 1,2 × 102 UFC/g a fronte di un limite di 100 UFC/g. Con un'incertezza estesa tipica di diversi decimi di log, il valore reale potrebbe essere al di sotto del limite. Il prodotto è conforme o no? La risposta dipende dalla regola decisionale. La ISO/IEC 17025 richiede che, quando il laboratorio dichiara la conformità, documenti la regola che usa e il rischio di accettare o rifiutare per errore. Un criterio abituale considera non conforme un risultato solo se supera il limite di più dell'incertezza estesa; un altro, più conservativo, considera conforme solo ciò che resta al di sotto del limite meno tale incertezza. Scegliere tra i due è una decisione di gestione del rischio, non un dettaglio del laboratorio.
Errori comuni
- Leggere "non rilevato" come garanzia di assenza in tutto il lotto.
- Confrontare i metodi solo in base al tempo di risposta, senza controllare il loro LOD50 nella matrice di interesse.
- Riportare "0 UFC/g" invece di "< limite di quantificazione".
- Trattare differenze di 0,2 o 0,3 log tra due conte come un cambiamento reale del processo.
- Richiedere la dichiarazione di conformità senza concordare prima la regola decisionale.
Conclusione
In microbiologia un risultato non arriva mai da solo: porta con sé una probabilità di rilevamento se è qualitativo e un'incertezza se è quantitativo. Il LOD50 permette di confrontare i metodi e di capire cosa significhi davvero un negativo; la ISO 19036 permette di attribuire un intervallo a ogni conta. Usare questi margini, insieme a una regola decisionale concordata, è ciò che evita di rilasciare o respingere un lotto per una differenza che il metodo stesso non è in grado di distinguere.
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Domande frequenti
Che cos'è il LOD50 di un metodo microbiologico?
È la concentrazione del microrganismo alla quale un metodo di rilevamento dà esito positivo nel 50 % delle porzioni analizzate. Si usa perché in microbiologia il rilevamento è probabilistico: anche un metodo perfetto raggiunge solo il 50 % di rilevamento con circa 0,69 UFC medie per porzione, a causa della distribuzione casuale delle cellule.
Perché un risultato "non rilevato" non significa zero?
Perché il metodo analizza solo una porzione del campione e ha un limite di rilevamento. Se il microrganismo è a bassa concentrazione o distribuito in modo irregolare, può non trovarsi nella porzione analizzata o non raggiungere livelli rilevabili.
Quale norma si usa per stimare l'incertezza di una conta microbiologica?
La ISO 19036:2019. Combina l'incertezza tecnica, quella di matrice e quella distribuzionale, ed esprime il risultato come incertezza estesa con un fattore di copertura k = 2, circa il 95 % di confidenza.
L'incertezza di misura include l'errore di campionamento del lotto?
No. La ISO 19036 esclude espressamente l'incertezza di campionamento, cioè l'errore di prelevare il campione dal lotto. Tale rischio si gestisce con la progettazione del piano di campionamento.