Piani di campionamento per attributi: come leggere n, c, m e M in un criterio microbiologico

Perché un solo campione non basta

I microrganismi non si distribuiscono in modo uniforme in un lotto. Possono concentrarsi in pochi imballaggi, in una zona di un sacco o in grumi all'interno di una polvere. Per questo, quando la decisione è accettare o respingere un lotto di materia prima o di prodotto finito, analizzare una sola unità dice molto poco. Il Codex Alimentarius lo riassume in un'avvertenza da tenere presente: un piano di campionamento ben progettato definisce la probabilità di rilevare microrganismi in un lotto, ma nessun piano può assicurare l'assenza di un determinato organismo.

Questo articolo tratta il campionamento dei lotti. Il prelievo di campioni su superfici e ambiente di stabilimento è spiegato nelle guide sul campionamento delle superfici e sul monitoraggio ambientale.

Che cos'è un criterio microbiologico

Secondo i principi del Codex per stabilire e applicare criteri microbiologici (CXG 21-1997, rivisti nel 2013), un criterio comprende il microrganismo di interesse, il piano di campionamento con il numero di unità da prelevare e la dimensione dell'unità analitica, i limiti microbiologici, il numero di unità che devono rispettarli, i metodi analitici e, in base alla sua finalità, un'indicazione della prestazione statistica del piano. Un criterio senza piano di campionamento è solo un numero.

Il Codex distingue due tipi di piani. I piani per variabili usano le conte senza raggrupparle e richiedono di conoscere la distribuzione dei microrganismi nel lotto, per cui si usano poco. I piani per attributi classificano ogni unità come conforme o non conforme e sono, in pratica, i più impiegati per accettare i lotti. La loro unica esigenza è che le unità siano prelevate con una tecnica probabilistica, come il campionamento casuale semplice o stratificato, su tutto il lotto.

I quattro parametri: n, c, m e M

• n: numero di unità campionarie prelevate dal lotto, in modo indipendente e casuale.
• c: numero massimo di unità che possono dare un risultato non desiderato senza che il lotto venga respinto.
• m: limite microbiologico che separa le unità conformi da quelle non conformi (in un piano a due classi) o da quelle marginalmente accettabili (in uno a tre).
• M: in un piano a tre classi, il limite oltre il quale un'unità è inaccettabile.

Piani a due classi

Ogni unità è conforme o non conforme. È il piano tipico per i patogeni, dove si analizza presenza o assenza in una quantità definita e c è di solito 0. Ad esempio, il Regolamento (CE) 2073/2005 richiede per Salmonella nelle carni macinate destinate a essere consumate crude n = 5 e c = 0, con assenza in 25 g: basta un positivo in una qualsiasi delle cinque unità perché il risultato sia insoddisfacente.

Piani a tre classi

Si usano con le conte. Le unità al di sotto di m sono conformi, quelle comprese tra m e M sono marginalmente accettabili e quelle che superano M sono inaccettabili. Nello stesso regolamento, il criterio di igiene del processo per E. coli nelle carni macinate è n = 5, c = 2, m = 50 UFC/g e M = 500 UFC/g. Il risultato è soddisfacente se tutti i valori sono inferiori a m; accettabile se al massimo due su cinque cadono tra m e M e il resto è inferiore a m; e insoddisfacente se un valore supera M o più di due si collocano tra m e M.

Quanto è davvero esigente un piano

La prestazione di un piano si descrive con la sua curva caratteristica operativa (curva OC), che mostra la probabilità di accettare un lotto in base alla proporzione di unità difettose che contiene. Il Codex richiede che il piano riporti tali caratteristiche statistiche. Un semplice calcolo per piani con c = 0 lo rende evidente:

• Un lotto in cui il 10 % delle unità è contaminato viene accettato con una probabilità di 0,9⁵, cioè circa il 59 %, se si prelevano 5 unità. Con 30 unità la probabilità scende a circa il 4 %.
• Se solo l'1 % delle unità è contaminato, un piano da 5 unità accetta il lotto circa il 95 % delle volte, e uno da 60 unità circa il 55 %.

La conclusione è scomoda ma importante: i piani con poche unità rilevano bene i lotti molto contaminati e molto male quelli con contaminazione bassa e dispersa. Aumentare n rende la curva più ripida e migliora la discriminazione; abbassare c riduce il rischio per il consumatore ma aumenta la probabilità di respingere lotti accettabili. Lo strumento gratuito per i piani di campionamento dell'ICMSF, un foglio di calcolo, stima queste probabilità per piani a due e tre classi.

Lo schema dei casi dell'ICMSF

La Commissione internazionale per le specifiche microbiologiche degli alimenti (ICMSF) ha proposto di adeguare l'esigenza del piano al rischio, con 15 casi che combinano la gravità del pericolo e ciò che può accadere all'alimento tra il campionamento e il consumo: che le condizioni riducano il pericolo, che non lo modifichino o che possano aumentarlo. Per i pericoli gravi (casi da 10 a 12) i piani a due classi con c = 0 usano 5, 10 e 20 unità; per i pericoli severi (casi da 13 a 15), 15, 30 e 60 unità.

Un'analisi statistica pubblicata dall'ICMSF (Dahms, 2004), che assume una distribuzione log-normale con deviazione standard di 0,8 log, stima che il caso 10 (n = 5, c = 0, assenza in 25 g) respinga con una probabilità del 95 % i lotti con una media geometrica di 1 UFC ogni 32 g, mentre il caso 15 (n = 60) arriva a lotti di 1 UFC ogni 526 g. La differenza mostra perché gli alimenti destinati a popolazioni sensibili ricevono i piani più rigorosi: lo stesso Regolamento 2073/2005 richiede n = 30 per Salmonella nelle formule per lattanti disidratate.

Unità campionaria, unità analitica e campioni compositi

L'unità campionaria è ciò che si preleva dal lotto; l'unità analitica è la porzione che si analizza (ad esempio 25 g). Il Bacteriological Analytical Manual (BAM) della FDA raccomanda di ottenere almeno 100 g per unità campionaria e classifica gli alimenti in tre categorie per Salmonella, con 60, 30 o 15 unità analitiche in base alla sensibilità del consumatore e all'esistenza di una successiva fase letale.

Per ridurre il carico di lavoro, il BAM consente di combinare quindici unità da 25 g in un campione composito da 375 g, salvo diversa indicazione del metodo. Il Codex circoscrive questa pratica: la composizione dei campioni può essere considerata nelle analisi di presenza o assenza all'interno di un piano a due classi, purché non influisca sul risultato rispetto all'analisi delle singole unità, ma non è appropriata per le conte né per i piani a tre classi, perché diluisce la concentrazione di ciascuna unità.

Regole pratiche che spesso si dimenticano

• Non ripetere l'analisi per "confermare" un lotto: il Codex indica che, salvo che il piano lo preveda, un lotto non dovrebbe essere sottoposto a una nuova analisi. Campionare fino a ottenere un negativo annulla la logica statistica del piano.
• Il piano è un minimo quando si valuta un lotto: il Regolamento 2073/2005 stabilisce che, se l'obiettivo è valutare l'accettabilità di un lotto, i suoi piani devono essere rispettati almeno nei valori minimi. Consente di ridurre il numero di unità solo quando l'operatore dimostra, con storico documentato, procedure efficaci basate sull'HACCP.
• Finestre mobili per verificare i processi: quando l'obiettivo è verificare un processo e non accettare un lotto, il Codex descrive l'approccio a finestra mobile, che confronta sempre gli ultimi n risultati con i limiti.
• Il campionamento prevale sul metodo: un metodo con un eccellente limite di rilevamento non compensa un piano con poche unità in un lotto con contaminazione dispersa, come avviene negli alimenti a bassa umidità.

Una volta prelevate, le unità devono arrivare al laboratorio senza alterazioni. Le condizioni di spedizione sono dettagliate nell'articolo sul trasporto e la conservazione dei campioni.