Questo articolo approfondisce uno dei requisiti spiegati in accreditamento ISO/IEC 17025 nei laboratori alimentari e integra convalida e verifica dei metodi microbiologici.
Indice dell'articolo
Che cos'è una prova valutativa e in che cosa si distingue da altri confronti
Un laboratorio con metodi convalidati e analisti formati può portarsi dietro un errore sistematico che nessuno rileva dall'interno. Il modo per vederlo è confrontare i suoi risultati con quelli di altri laboratori che analizzano lo stesso materiale. ISO/IEC 17043:2023 definisce il confronto interlaboratorio come l'organizzazione, l'esecuzione e la valutazione di misure o prove sugli stessi oggetti o su oggetti simili da parte di due o più laboratori, secondo condizioni predeterminate. La prova valutativa (in inglese proficiency testing o PT) è un caso particolare: valuta le prestazioni di ogni partecipante rispetto a criteri fissati in anticipo, per mezzo di un confronto interlaboratorio.
Non ogni confronto valuta il laboratorio. Uno studio interlaboratorio per ottenere le caratteristiche di prestazione di un metodo, come quelli della serie ISO 16140 descritta in convalida e verifica dei metodi microbiologici, misura il metodo e non il partecipante.
Che cosa richiede ISO/IEC 17025
Il punto 7.7 di ISO/IEC 17025:2017 richiede una procedura per assicurare la validità dei risultati. Il punto 7.7.1 riunisce le misure interne (materiali di riferimento, controlli, ripetizioni, confronto tra analisti) e il 7.7.2 aggiunge lo sguardo esterno: il laboratorio deve monitorare le proprie prestazioni confrontandole con i risultati di altri laboratori, mediante prove valutative o altri confronti interlaboratorio, quando disponibili e appropriati. Il quadro generale dell'accreditamento è in accreditamento ISO/IEC 17025 nei laboratori alimentari.
La politica ILAC-P9:01/2024, applicata dagli organismi di accreditamento firmatari dell'accordo di mutuo riconoscimento ILAC, traduce questo requisito in regole concrete:
- La partecipazione è considerata obbligatoria quando la prova valutativa è disponibile, è appropriata e viene ritenuta necessaria in base all'analisi dei rischi del laboratorio.
- Il laboratorio deve avere un piano di partecipazione, e l'organismo di accreditamento lo valuta prima di concedere l'accreditamento per verificare che copra lo scopo in modo rappresentativo.
- Quando le prestazioni non sono soddisfacenti, l'organismo valuta le evidenze di azioni correttive tempestive e adeguate.
Livello e frequenza di partecipazione
Nessuno partecipa a una prova per ogni combinazione di metodo, analita e matrice. ILAC-P9, seguendo la guida EA-4/18 G:2021, propone di raggruppare lo scopo in aree di competenza tecnica: combinazioni di tecnica, caratteristica e prodotto sufficientemente equivalenti perché il risultato di una rappresenti le altre. Tecniche diverse raramente rientrano in una stessa area; prodotti diversi sì, se le matrici sono di natura equivalente. La frequenza minima per area la fissa il laboratorio in base al rischio: volume di analisi, rotazione ed esperienza del personale, stabilità dell'analita e della matrice, robustezza del metodo e uso finale del dato. La guida cita la sicurezza alimentare tra le aree che richiedono un alto livello di garanzia.
Le tre norme su cui si regge una prova valutativa in microbiologia
ISO/IEC 17043:2023: la competenza dell'organizzatore
Fissa i requisiti di competenza e imparzialità degli organizzatori di prove valutative. La seconda edizione, del maggio 2023, ha sostituito quella del 2010, che secondo ILAC-P9 restava valida fino a maggio 2026. Per il partecipante, la domanda pratica è se l'organizzatore sia accreditato secondo questa norma da un organismo firmatario dell'accordo ILAC, che è il modo riconosciuto di dimostrarne la competenza.
ISO 13528:2022: la statistica
Descrive i metodi statistici per progettare gli schemi e analizzarne i dati, e fornisce raccomandazioni per interpretare i risultati, sia quantitativi sia qualitativi. La terza edizione è dell'agosto 2022 e ha un emendamento pubblicato nel 2026. Qui si trovano i metodi per fissare il valore assegnato (il valore di riferimento del circuito), lo scarto tipo per la valutazione della prova (σpt, che definisce quanto si tollera) e i punteggi di prestazione.
ISO 22117:2019: lo specifico della microbiologia
Ha sostituito la specifica tecnica ISO/TS 22117:2010 ed è stata confermata nel suo riesame periodico. Stabilisce requisiti e orientamenti per organizzare schemi di prove valutative nella microbiologia di alimenti e bevande, alimentazione animale, campioni ambientali della produzione e della manipolazione di alimenti e mangimi, e produzione primaria; anche dell'acqua usata nella produzione di alimenti o considerata alimento dalla legislazione nazionale. Copre l'organizzazione tecnica dello schema e il trattamento statistico dei risultati, ed è pensata per essere usata insieme a ISO/IEC 17043 e ISO 13528: aggiunge solo ciò di cui la microbiologia ha bisogno in più. Un esempio è la preparazione del materiale: uno schema del 2021 in India per Listeria monocytogenes e Salmonella in gamberetti liofilizzati ha verificato l'omogeneità e la stabilità dell'oggetto durante la conservazione (fino a 28 giorni) e il trasporto (fino a 6 giorni) prima di spedirlo.
Come si legge uno z-score
Il punteggio più usato è lo z-score: z = (xi − xpt) / σpt, dove xi è il risultato del laboratorio, xpt il valore assegnato e σpt lo scarto tipo per la valutazione. L'interpretazione abituale, tratta da ISO 13528 e ripresa dalla guida Eurachem del 2021, è:
- |z| ≤ 2,0: prestazione soddisfacente, nessun segnale.
- 2,0 < |z| < 3,0: prestazione discutibile, segnale di attenzione.
- |z| ≥ 3,0: prestazione insoddisfacente, segnale di azione.
Un esempio illustrativo: se il valore assegnato di una conta è 4,20 log UFC/g, σpt è 0,25 log e il laboratorio riporta 4,85 log UFC/g, z = 0,65 / 0,25 = 2,6: discutibile. Che cosa rappresenta un'UFC e come si interpreta una conta è spiegato in che cosa sono le UFC.
Due avvertenze. Primo, lo z-score dipende da σpt: più è grande, più z è piccolo e migliore sembra la prestazione, quindi conviene verificare se quel valore ha senso per l'uso che il laboratorio fa dei propri risultati. Secondo, lo z-score non tiene conto dell'incertezza del valore assegnato. Se questa incertezza tipo è inferiore a 0,3·σpt, è considerata trascurabile; altrimenti l'organizzatore deve usare un altro modo per fissare il valore assegnato, punteggi che la incorporino, come z′ o zeta (ζ), oppure informarne i partecipanti. Il rapporto tra questi punteggi e l'incertezza del laboratorio stesso è trattato in limite di rilevabilità e incertezza di misura.
Prove qualitative: quando il risultato è rilevato o non rilevato
La maggior parte delle analisi dei patogeni è di presenza o assenza, e in questo caso non ha senso calcolare medie né scarti tipo. ISO 13528 prevede di fissare il valore assegnato in base alla preparazione nota dell'oggetto, a materiali di riferimento o al giudizio di esperti, e la prestazione si valuta con criteri di risposte corrette su campioni positivi e negativi. La prova del 2024 del laboratorio di riferimento dell'UE per Salmonella, il cui disegno generale si basa su ISO 22117, mostra come si fa:
- Vi hanno partecipato 68 laboratori nazionali di riferimento, che hanno analizzato con EN ISO 6579-1 tamponi di tessuto contaminati con S. Typhimurium a diversi livelli e campioni non contaminati.
- Il criterio di buona prestazione richiedeva almeno 2 positivi su 3 al livello alto (37,5 UFC per campione), almeno 2 su 4 al livello basso (4,5 UFC per campione) e 0 positivi su 3 nei negativi.
- Sessantacinque laboratori hanno soddisfatto il criterio. Uno ha fallito al livello basso, ma ha dimostrato la propria capacità con campioni di livello extra basso e la sua valutazione è passata a prestazione moderata. Altri due non sono stati valutati perché il pacco ha impiegato 25 giorni ad arrivare e non si poteva garantire la sopravvivenza del batterio.
Quest'ultimo punto insegna qualcosa: un cattivo risultato può dipendere dall'oggetto e non dal laboratorio. Nei due circuiti indiani citati, circa il 16 % dei laboratori di ciascun circuito ha avuto risultati insoddisfacenti, quasi tutti per falsi positivi. Gli autori hanno indicato come cause probabili la ricostituzione errata del campione o il tempo insufficiente tra ricostituzione e analisi, errori operativi, contaminazione crociata e carenze nell'identificazione o nella conferma delle colonie tipiche. Quest'ultimo aspetto si collega a quanto spiegato in risultato presunto vs. confermato. In Francia, i laboratori nazionali di riferimento hanno organizzato tra il 2019 e il 2021 uno schema comune per i laboratori ufficiali, con una media di 65 partecipanti all'anno.
Che cosa fare davanti a un risultato discutibile o insoddisfacente
La guida Eurachem è chiara sul principio: ogni risultato insoddisfacente deve essere indagato e documentato, e la valutazione si registra anche se si decide di non intraprendere azioni. Un solo cattivo risultato non prova che il laboratorio sia incompetente, ma una cattiva prestazione ripetuta indica un problema serio, e allora il laboratorio dovrebbe valutare di sospendere quella prova finché non lo risolve. L'indagine si gestisce all'interno della procedura per le non conformità del laboratorio. Un ordine pratico:
- Esaminare il rapporto. Confermare che i risultati pubblicati siano quelli inviati e capire come è stato calcolato il punteggio.
- Escludere errori amministrativi. Trascrizione, etichettatura, decimali o unità. Se si ripetono, il problema è nel sistema di gestione, non nella tecnica.
- Esaminare la parte tecnica. Conservazione e ricostituzione dell'oggetto, dati del controllo interno della corsa, apparecchiature, reagenti e taratura, condizioni ambientali ed elaborazione dei dati. In microbiologia, ciò include il controllo delle prestazioni dei terreni descritto in controllo qualità dei terreni secondo ISO 11133 e, se si è usata la PCR, i controlli spiegati in controlli di una PCR.
- Esaminare lo schema. Differenze di matrice rispetto ai campioni di routine, deterioramento dell'oggetto, livelli fuori dall'intervallo del metodo, valore assegnato o σpt inadeguati, gruppo di confronto scelto male o errori dell'organizzatore.
- Chiudere il ciclo. Analizzare la causa con i dati grezzi, il circuito completo, i circuiti precedenti e il controllo interno; pianificare l'azione correttiva, attuarla e registrarla, e verificarne l'efficacia, idealmente con una nuova partecipazione.
Per i risultati discutibili, Eurachem suggerisce di definire quando indagarli: per esempio, in caso di punteggi discutibili ripetuti o di risultati consecutivi con lo stesso segno di scostamento.
Come trarne vantaggio
L'oggetto va trattato come un campione di routine: stesso metodo, stesso flusso e gli analisti che trattano i campioni abituali. Conviene scegliere schemi la cui matrice e il cui livello somiglino alla routine e riportare il metodo usato; nella prova europea del 2024, venti laboratori hanno riportato anche i risultati di un secondo metodo.
Che rapporto hanno i kit TAAG con le prove valutative
TAAG non organizza prove valutative né produce materiali per esse. Ma un laboratorio che usa un kit TAAG nella sua routine deve coprire quel metodo nel proprio piano di partecipazione. Due esempi del catalogo sono Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97, PCR real-time con sonde fluorescenti, design con Mila), con sensibilità dichiarata di 1 UFC/25 g e matrici convalidate di coscia di pollo cruda, hamburger di bovino surgelato, longanicilla, mortadella e superficie, e Specio 2.3 Listeria spp. and L. monocytogenes (V-SF04, PCR real-time con curva di melting), con sensibilità dichiarata di 1 UFC/25 g negli alimenti e matrici dichiarate di alimenti, bevande e superfici vive e inerti. Entrambi sono qualitativi: un positivo è presunto fino a conferma. Il catalogo non registra certificazioni di terze parti per questi kit, per cui un buon risultato in una prova valutativa dimostra la prestazione del laboratorio con quel metodo, ma non sostituisce la convalida rispetto al metodo di riferimento che la serie ISO 16140 richiede per usarlo al suo posto. Se la matrice dello schema non è tra quelle dichiarate, conviene confermare l'ambito con TAAG prima di partecipare.
Conclusione
Una prova valutativa è il modo più diretto che un laboratorio di microbiologia ha per sapere se i suoi risultati coincidono con quelli dei suoi pari. ISO/IEC 17025 la richiede quando è disponibile e appropriata, ISO/IEC 17043 assicura che l'organizzatore sia competente, ISO 13528 definisce come si assegna il punteggio e ISO 22117 aggiunge ciò che richiedono i batteri vivi: omogeneità, stabilità e valutazione dei risultati qualitativi. Leggere bene uno z-score o un criterio di risposte corrette, e capire che un cattivo risultato può venire dal laboratorio o dall'oggetto, è ciò che trasforma la partecipazione in un miglioramento reale. Il suo valore sta meno nel superare il circuito che nell'indagare a fondo ogni segnale di attenzione e di azione.
Informazioni su TAAG
Se il tuo laboratorio usa Ampliora 1.1 Salmonella spp. o Specio 2.3 Listeria spp. and L. monocytogenes, verifica con TAAG l'ambito delle matrici prima di includerli nel tuo piano di prove valutative.
Domande frequenti
Che differenza c'è tra una prova valutativa e un confronto interlaboratorio?
Il confronto interlaboratorio è qualsiasi esercizio in cui due o più laboratori analizzano oggetti uguali o simili in condizioni predeterminate. La prova valutativa è il confronto che si usa per valutare le prestazioni di ogni partecipante rispetto a criteri fissati in anticipo, secondo le definizioni di ISO/IEC 17043:2023. Uno studio interlaboratorio per convalidare un metodo, invece, valuta il metodo e non il laboratorio.
È obbligatorio partecipare a prove valutative per essere accreditati ISO/IEC 17025?
Il punto 7.7.2 richiede di confrontare le prestazioni con quelle di altri laboratori quando sono disponibili e appropriate prove valutative o altri confronti. La politica ILAC-P9:01/2024 lo considera obbligatorio quando è disponibile, è appropriato e l'analisi dei rischi lo rende necessario, e richiede un piano di partecipazione che l'organismo di accreditamento valuta.
Come si interpreta uno z-score?
Si calcola sottraendo il valore assegnato dal risultato del laboratorio e dividendo per lo scarto tipo per la valutazione della prova. Con |z| ≤ 2 la prestazione è soddisfacente, tra 2 e 3 è discutibile (segnale di attenzione) e con |z| ≥ 3 è insoddisfacente (segnale di azione). Il valore dipende molto dallo scarto scelto dall'organizzatore, quindi conviene verificarlo.
Come si valuta una prova valutativa di rilevamento di patogeni, dove non ci sono numeri?
Nelle prove qualitative non si calcolano medie né z-score. La prestazione si giudica dalle risposte corrette su campioni positivi a diversi livelli e su campioni negativi. Nella prova europea su Salmonella del 2024, per esempio, si richiedevano almeno 2 positivi su 3 al livello alto, 2 su 4 al livello basso e nessun positivo nei negativi.
Che cosa deve fare un laboratorio davanti a un risultato insoddisfacente?
Indagarlo e documentarlo sempre, all'interno della procedura per le non conformità. Prima si escludono errori di trascrizione o di unità, poi si esaminano la manipolazione dell'oggetto, il controllo interno, i terreni, le apparecchiature e i reagenti, e infine lo schema stesso. L'azione correttiva si pianifica, si attua, si registra e se ne verifica l'efficacia, idealmente con una nuova partecipazione.