Questo articolo segue il campione dopo trasporto e conservazione dei campioni e completa i piani di campionamento per attributi con ciò che succede dentro il laboratorio.
Indice dell'articolo
Il passaggio che nessuno vede nel rapporto
Un risultato microbiologico si riporta come "assenza in 25 g" o "3.200 UFC/g", ma tra il sacchetto che arriva in laboratorio e la piastra o il brodo c'è una fase che non compare quasi mai nel rapporto: la preparazione del campione. Quanto si pesa, in quale diluente, quanto si omogeneizza, quanto attende la sospensione e se si riuniscono porzioni: ogni decisione cambia il significato del numero. Il prelievo dei campioni nello stabilimento è in campionamento delle superfici e il trasferimento fino al laboratorio in trasporto e conservazione dei campioni; questo articolo inizia dove quelli finiscono, con il campione già ricevuto.
Il riferimento internazionale per questa fase è la serie ISO 6887, del comitato ISO/TC 34/SC 9. Ha sei parti: la 6887-1:2017 fissa le regole generali e le altre cinque le declinano per gruppi di prodotti: carni (6887-2:2017), pesci e prodotti della pesca (6887-3:2017), prodotti vari come uova, vegetali, cacao, erbe e spezie (6887-4:2017), latte e prodotti lattiero-caseari (6887-5:2020) e campioni della produzione primaria, dall'allevamento al macello (6887-6:2013). Se il metodo specifico di un microrganismo contiene istruzioni proprie, queste hanno la priorità.
La sospensione iniziale 1:10, passo dopo passo
Pesata e proporzione
ISO 6887-1 richiede di pesare o misurare la porzione analitica con una tolleranza di ±5 %, con un minimo di 10 g o 10 mL salvo diversa indicazione del metodo, e di aggiungere 9 volte quella quantità di diluente, misurato preferibilmente in massa con una tolleranza di ±2 %. Si ottiene così la diluizione 1:10. La norma ammette altre proporzioni quando servono: 1 a 20, 1 a 50 o 1 a 100 per prodotti che danno sospensioni troppo dense, e 1 a 2 o 1 a 5 quando si cercano conte basse, pur avvertendo che queste ultime possono squilibrare il rapporto tra inoculo e terreno e vanno verificate caso per caso. Qualsiasi proporzione non standard si riporta nel calcolo finale.
Diluenti
Per l'uso generale la norma definisce due diluenti: la soluzione salina peptonata (1 g di digerito enzimatico di caseina e 8,5 g di cloruro di sodio per litro) e l'acqua peptonata tamponata, entrambi con pH finale di 7,0 ± 0,2 a 25 °C. Esiste inoltre una versione a doppia concentrazione dell'acqua peptonata tamponata per prodotti molto acidi. Il volume finale non può discostarsi più di ±2 % e i diluenti devono superare una prova di prestazione: dopo un periodo da 45 minuti a 1 ora a temperatura ambiente, la conta del ceppo di controllo deve restare entro ±30 % di quella iniziale. I requisiti di prestazione di diluenti e terreni sono descritti in ISO 11133.
Omogeneizzazione
La miscela si omogeneizza secondo ISO 7218 (quarta edizione, del 2024), con un omogeneizzatore rotante (frullatore da laboratorio) o uno peristaltico, l'apparecchio a palette che batte un sacchetto sterile e che nei laboratori viene di solito chiamato stomacher. Se necessario, le particelle grandi si lasciano sedimentare fino a 15 minuti; i sacchetti con filtro integrato sono un'alternativa equivalente. Per prodotti duri o secchi, la norma limita l'omogeneizzatore rotante a 2,5 minuti consecutivi e la triturazione o macinazione preliminare a 1 minuto, per evitare che il campione si riscaldi. Il manuale della FDA per gli alimenti (BAM, capitolo 1) usa per le conte 50 g di campione in 450 mL di diluente fosfato di Butterfield, frullati per 2 minuti.
Tempi massimi
ISO 6887-1 stabilisce che tra la fine della preparazione della sospensione iniziale e il contatto dell'inoculo con il terreno di coltura finale non possono passare più di 45 minuti, e che tra la sospensione iniziale e l'inizio delle diluizioni non possono passare più di 30 minuti. Se il laboratorio è sopra i 27 °C, entrambi i tempi andrebbero ridotti. Il BAM è più severo: non più di 15 minuti dall'omogeneizzazione al momento in cui tutte le diluizioni sono nei rispettivi terreni. In una sospensione ricca di nutrienti i microrganismi possono iniziare a moltiplicarsi e il risultato esce più alto del campione reale.
Diluizioni decimali
Per ogni passaggio decimale si trasferisce 1 mL ± 0,02 mL in una provetta con 9 mL ± 0,2 mL di diluente, senza immergere la pipetta più di 1 cm, mescolando da 5 a 10 secondi e con un puntale nuovo a ogni passaggio.
Regole per tipo di alimento
Surgelati
Per le confezioni piccole (in genere meno di 2 kg), ISO 6887-1 consente di portarle a una consistenza che permetta di prelevare la porzione, a 18-27 °C per un massimo di 3 ore o a 5 ± 3 °C per un massimo di 24 ore, e sconsiglia di scongelare a bagnomaria o sotto il getto d'acqua, per il rischio di contaminazione se la confezione non è ermetica. Il BAM preferisce non scongelare e, se necessario, lo fa a 2-5 °C in un massimo di 18 ore, o al di sotto di 45 °C per non più di 15 minuti con agitazione in bagno termostatato.
Carni
ISO 6887-2 copre carni fresche, refrigerate, congelate, salate, fermentate, macinate, preparazioni a base di carne, carne separata meccanicamente, carni cotte, essiccate e affumicate, estratti concentrati e campioni di carcassa prelevati per escissione o tampone. Distingue, tra gli altri casi, blocchi e tagli, insaccati con budello e campioni di superficie o di profondità. Il campionamento sulla carcassa è materia di ISO 17604. Il contesto del settore è in microbiologia nell'industria della carne.
Prodotti lattiero-caseari
ISO 6887-5 ha procedure proprie per latte liquido, latte e siero in polvere, formaggi, caseine e caseinati (con un caso particolare per la caseina presamica), burro, gelati, dessert a base di latte con pH superiore a 5, latti fermentati e yogurt con pH inferiore a 5 e formule per lattanti in polvere. Il BAM illustra perché non si può trattare tutto allo stesso modo: per Salmonella nel formaggio frulla 25 g con 225 mL di brodo lattosato per 2 minuti, lascia riposare 60 minuti e porta il pH a 6,8 ± 0,2; il latte scremato in polvere istantaneo, invece, viene versato delicatamente sulla superficie del brodo e incubato senza mescolare.
Pesci e frutti di mare
ISO 6887-3 comprende pesce intero o in filetti, crostacei, cefalopodi, molluschi bivalvi, gasteropodi, tunicati ed echinodermi, oltre ad affumicati, cotti e blocchi congelati, e include procedure speciali per molluschi, tunicati ed echinodermi crudi provenienti da zone di produzione primaria.
Alimenti secchi, acidi e grassi
- Bassa umidità: pesare prima il diluente e poi aggiungere la porzione, per ridurre lo shock osmotico, e lasciare in ammollo fino a 1 ora se il prodotto è duro. Il BAM, per le polveri, aggiunge prima circa 15 mL di brodo, forma una sospensione senza grumi e completa il volume a porzioni.
- Acidi: la sospensione deve tornare a pH 7,0 ± 0,5. L'acqua peptonata tamponata basta per prodotti con pH 4,5 o superiore; tra pH 3,5 e 4,5 si può usare quella a doppia concentrazione, verificando il pH la prima volta.
- Grassi (oltre il 20 %): si può aggiungere polisorbato 80 al diluente, tra 1 e 10 g/L; in genere basta 1 g/L per ogni 10 % di grasso.
- Spezie inibitorie: il BAM aggiunge solfito di potassio allo 0,5 % per cipolla e aglio disidratati, e diluisce pimento, cannella e origano a 1:100 e i chiodi di garofano a 1:1000, perché non si conosce un modo per neutralizzarne l'effetto.
Compositi e riuniti: non è la stessa cosa
Riunire unità di uno stesso lotto fa risparmiare lavoro e reagenti. L'emendamento 1 del 2024 a ISO 6887-1 precisa due concetti che nella pratica si confondono:
- Campione composito: si mescolano diverse unità e dalla miscela si preleva una porzione della dimensione indicata dal metodo, per esempio 25 g. Il risultato continua a essere espresso su 25 g.
- Campione riunito (pooling): si riuniscono diverse unità o porzioni e si analizza l'intera miscela. Il risultato si esprime sulla massa totale, per esempio 100 g o 375 g.
Si può riunire fuori dal laboratorio, unendo campioni individuali in uno più grande, o al suo interno, unendo porzioni in un unico grande pre-arricchimento o unendo brodi già pre-arricchiti. Ci sono regole precise: solo per prove qualitative, solo con unità della stessa origine (stesso lotto o partita) e senza combinare due modalità alla volta, per esempio riunire le porzioni e poi riunire anche i loro brodi.
25 g o 375 g: che cosa cambia aumentando la porzione
Lo schema classico viene dal BAM: da ogni unità di campione si preleva una porzione di 25 g e fino a 15 porzioni possono essere riunite in un composito di 375 g, che si analizza per intero mantenendo la proporzione 1:9 (375 g in 3.375 mL di brodo). Il numero di unità dipende dalla categoria dell'alimento: 60 per la categoria I (senza fase letale e destinato ad anziani, malati o lattanti), 30 per la II e 15 per la III, cioè 4, 2 o 1 composito da 375 g. Un solo positivo fa respingere il lotto. Il BAM esclude dalla composizione, tra gli altri, il latte in polvere non istantaneo e il latte intero in polvere.
L'emendamento del 2024 pone condizioni tecniche perché il grande volume non nasconda un positivo:
- Il brodo di pre-arricchimento deve essere preriscaldato alla temperatura di incubazione.
- Bisogna conoscere il profilo di temperatura del grande volume. Prendendo l'esempio di ISO 6579-1, il cui pre-arricchimento dura tra 16 e 20 ore, la miscela deve restare tra 34 °C e 38 °C per almeno 16 ore, e il tempo per raggiungere quella temperatura deve essere ridotto al minimo.
- La proporzione campione/diluente del metodo convalidato non si cambia, salvo per aumentarla in matrici inibitorie come cipolla in polvere, aglio, origano, peperoni, alcuni tè e caffè, premiscele vitaminiche o prodotti molto salati.
- Un campione di laboratorio superiore al massimo si divide: 750 g si trattano come due porzioni da 375 g.
Inoltre, la dimensione maggiore deve essere convalidata. Se lo è stata in uno studio secondo ISO 16140-2 o ISO 16140-5, ogni laboratorio deve solo verificarla secondo ISO 16140-3 all'interno della stessa categoria di alimento; altrimenti deve convalidarla da sé con il protocollo dell'allegato H dell'emendamento 1:2024 di ISO 16140-4, dimostrando con il livello relativo di rilevazione (RLOD) che il LOD50 non peggiora. Una volta convalidati 375 g, si possono usare porzioni più piccole alla stessa proporzione. Questi concetti sono spiegati in convalida e verifica dei metodi.
Le evidenze sostengono l'approccio quando è applicato bene. Tomás Fornés e collaboratori hanno convalidato la riunione di porzioni fino a 375 g per Salmonella con cinque metodi (coltura, ELISA e PCR real-time) su 23 alimenti (dolciumi, formula per lattanti, alimento per animali da compagnia, bevande in polvere, tra gli altri). In 22 dei 23 il RLOD50 rispetto a 25 g è risultato accettabile (inferiore a 2,5), a condizione di preriscaldare il brodo e rispettare il tempo massimo di incubazione. Il raggruppamento compare anche nella normativa: il Regolamento (CE) n. 2073/2005 richiede di riunire la pelle del collo di almeno tre carcasse di pollame dello stesso gruppo di origine in un campione da 26 g, e di riunire i tamponi di diversi siti di una carcassa prima dell'analisi. Come si leggono n e c in questi piani è in piani di campionamento per attributi, e perché la fase in brodo è decisiva in arricchimento microbiologico.
Quali kit e terreni TAAG si collegano
È il kit a definire per quale porzione è convalidato. Nel catalogo TAAG, Elevia 1.1 Salmonella spp. (V-PAT04, RT-qPCR con tecnologia AiGOR) dichiara una sensibilità di 1 UFC/375 g negli alimenti e 1 UFC/campione sulle superfici; la sua certificazione AOAC copre porzioni da 375 g di cioccolato al 62 % di cacao, liquore di cacao, latte scremato in polvere e arachidi, e TAAG dichiara inoltre matrici convalidate come cioccolatini ripieni, carne bovina macinata (90 % magra), pellet di mangime per animali, uova liquide pastorizzate e superfici in acciaio inossidabile. La sua scheda tecnica indica il supplemento Potentia 1 Salmonella spp. (V-PET06), un potenziatore di crescita per l'acqua peptonata tamponata. Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97, PCR real-time) dichiara 1 UFC/25 g, con matrici convalidate di coscia di pollo cruda, hamburger di carne surgelato, salsiccia tipo longaniza, mortadella e superfici, ed è associato a Augmentis 14 Universal Gram negative (V-FL46, flaconi da 225 mL, il volume di brodo per 25 g a 1:10). Usare un kit con una porzione, una matrice o uno schema di raggruppamento diversi da quelli dichiarati richiede la verifica o la convalida previste dall'emendamento di ISO 6887-1. Per scegliere in base alla matrice, vedi come scegliere un kit TAAG.
Conclusione
La preparazione del campione decide che cosa rappresenta un risultato tanto quanto il metodo di rilevamento. ISO 6887-1 fissa la sospensione iniziale 1:10, diluenti controllati, un'omogeneizzazione che non riscaldi il campione e un massimo di 45 minuti fino alla semina, e le parti da 2 a 6 adattano queste regole a carni, pesci, prodotti lattiero-caseari, prodotti secchi e produzione primaria. Comporre o riunire porzioni per i patogeni è uno strumento valido e sostenuto da evidenze, ma solo con unità dello stesso lotto, brodo preriscaldato, proporzione costante e una dimensione di porzione convalidata. Mettere per iscritto queste decisioni nella procedura del laboratorio è ciò che permette di confrontare i risultati tra turni, analisti e laboratori.
Informazioni su TAAG
Chiedi a TAAG se Elevia 1.1 Salmonella spp. o Ampliora 1.1 Salmonella spp. sono convalidati per la porzione analitica e lo schema di pooling che usa il tuo laboratorio.
Domande frequenti
Perché la sospensione iniziale si prepara a 1:10?
Perché ISO 6887-1 definisce la diluizione primaria come la porzione analitica mescolata con, di norma, nove volte la sua quantità di diluente, il che fornisce la base di una serie decimale. La norma ammette altre proporzioni, come 1 a 20 o 1 a 100 per prodotti densi, purché se ne tenga conto nel calcolo del risultato.
Quanto tempo può attendere una sospensione prima della semina?
Secondo ISO 6887-1, non più di 45 minuti dalla fine della sospensione iniziale al contatto dell'inoculo con il terreno finale, e non più di 30 minuti prima di iniziare le diluizioni. Se il laboratorio supera i 27 °C, questi tempi andrebbero ridotti. Il BAM della FDA fissa un massimo di 15 minuti dall'omogeneizzazione al momento in cui tutte le diluizioni sono nei rispettivi terreni.
Che differenza c'è tra un campione composito e uno riunito?
Nel composito si mescolano diverse unità e si analizza una porzione della dimensione del metodo, per esempio 25 g, e il risultato si esprime su 25 g. Nel riunito si analizza l'intera miscela, per esempio 375 g, e il risultato si esprime su quella massa totale. Entrambi valgono solo per prove qualitative e con unità dello stesso lotto.
Si possono analizzare 375 g invece di 25 g per Salmonella?
Sì, se il metodo è convalidato per quella porzione maggiore e si rispettano le condizioni dell'emendamento 1:2024 di ISO 6887-1: brodo preriscaldato, profilo di temperatura noto e la stessa proporzione campione/diluente. Se la dimensione non è stata convalidata secondo ISO 16140-2 o 16140-5, il laboratorio deve convalidarla con il protocollo dell'allegato H dell'emendamento di ISO 16140-4.
Come si scongela un campione prima dell'analisi?
ISO 6887-1 consente di lasciare le confezioni piccole a 18-27 °C fino a 3 ore o a 5 ± 3 °C fino a 24 ore, e sconsiglia il bagnomaria o il getto di acqua fredda. Il BAM preferisce non scongelare e, se necessario, usa 2-5 °C per un massimo di 18 ore o meno di 45 °C per non più di 15 minuti con agitazione.