Questo articolo integra che cosa sono le UFC e la coltura microbiologica tradizionale: spiega l'altro grande metodo di conta, quello che lavora con provette e probabilità.
Indice dell'articolo
Contare senza vedere le colonie
La conta in piastra conta ciò che si vede: ogni colonia sull'agar viene considerata un'unità formante colonia, come spiegato in che cosa sono le UFC e come si interpretano. Il metodo del numero più probabile (MPN, dall'inglese Most Probable Number) arriva a un valore per un'altra strada. Non conta colonie: distribuisce il campione in più provette di brodo, osserva quali mostrano crescita e, a partire da questa combinazione di positivi e negativi, calcola la concentrazione che con maggiore probabilità ha prodotto quel risultato.
L'Appendice 2 del Bacteriological Analytical Manual (BAM) della FDA attribuisce a McCrady, nel 1915, la prima stima precisa dei batteri vitali con questo approccio. È ancora in uso perché risolve situazioni in cui la piastra non funziona: concentrazioni basse, alimenti con particelle che si confondono con le colonie e microrganismi che richiedono un arricchimento prima di poter essere isolati.
Il principio statistico
L'idea è diluire finché alcune provette ricevono almeno una cellula vitale e altre nessuna. Se i batteri sono distribuiti in modo casuale, il numero di cellule che finisce in ogni provetta segue una distribuzione di Poisson, e la probabilità che una provetta resti senza cellule dipende solo dalla concentrazione e dalla quantità di campione inoculata. Con più diluizioni decimali e più provette per diluizione, lo schema delle provette positive permette di stimare la concentrazione originaria. L'MPN è, letteralmente, il valore di concentrazione che rende più probabile il risultato osservato; l'equazione si risolve per iterazione.
Le ipotesi che devono essere soddisfatte
Il BAM elenca quattro condizioni perché la stima sia valida:
- I batteri sono distribuiti in modo casuale nel campione.
- Sono separati, non aggregati, e non si respingono tra loro.
- Ogni provetta che riceve anche un solo organismo vitale produce crescita o una variazione rilevabile.
- Le provette sono indipendenti tra loro.
La terza ipotesi è la più esigente: il terreno deve consentire la crescita di una sola cellula, talvolta danneggiata, in presenza della flora associata. Per questo la qualità del brodo e della fase di arricchimento condiziona direttamente il risultato. Inoltre, l'MPN conta solo organismi vitali. Se i batteri formano catene o aggregati che la diluizione non separa, il BAM indica che il risultato va letto come unità di crescita o UFC, non come singole cellule.
Serie da 3, 5 e 10 provette
Lo schema più pubblicato prevede tre diluizioni decimali consecutive con 3, 5, 8 o 10 provette ciascuna; l'Appendice 2 riporta le tabelle per questi schemi, costruite per inoculi di 0,1, 0,01 e 0,001 g. Il capitolo 4 del BAM, dedicato a coliformi ed E. coli, indica che la serie a 3 provette si usa per la maggior parte degli alimenti; che nei molluschi bivalvi non si devono usare meno di 5 provette per diluizione; e che esiste un metodo a 10 provette per l'acqua in bottiglia o per campioni che non si prevede siano molto contaminati.
Più provette significano più informazione per diluizione e quindi intervalli più stretti e un limite inferiore più basso. Con le tabelle del BAM e gli inoculi di 0,1, 0,01 e 0,001 g, il risultato con tutte le provette negative si riporta come inferiore a 3,0 MPN/g nella serie a 3 provette e come inferiore a 1,8 MPN/g in quella a 5 provette. Il limite superiore dell'intervallo di confidenza di questo risultato nullo scende da 9,5 a 6,8 e, con 10 provette, a 3,1 MPN/g.
Come si leggono le tabelle
Il risultato si esprime come un codice di tre cifre: il numero di provette positive in ciascuna delle tre diluizioni scelte. Nella tabella a 3 provette, il codice 3-1-0 corrisponde a 43 MPN/g, con un intervallo di confidenza al 95 % da 9 a 180. Se gli inoculi usati erano dieci volte inferiori a quelli della tabella (0,01, 0,001 e 0,0001 g), il valore e i suoi limiti si moltiplicano per 10: 430 MPN/g. La stessa regola vale al contrario: inoculare quantità maggiori abbassa il limite di quantificazione.
Quando si seminano più di tre diluizioni, il BAM descrive una procedura per scegliere le tre da riportare in tabella. In sintesi, si scartano le diluizioni più alte che, insieme alla precedente, hanno tutte le provette negative, e si cerca la diluizione più alta con tutte le provette positive. La FDA mette inoltre a disposizione un'applicazione di calcolo e un foglio di calcolo per selezionare le diluizioni.
Le tabelle omettono le combinazioni così improbabili da far pensare a un errore di laboratorio o a una contaminazione. Se il codice ottenuto non è in tabella, il BAM lo considera un risultato improbabile: può dipendere da interferenze nelle diluizioni basse o dalla conferma di poche colonie e, se la causa non è nota, la stima può non essere affidabile.
Intervalli di confidenza: il valore arriva con un intervallo ampio
Un MPN va sempre letto insieme al suo intervallo. Nella serie a 5 provette, il codice 5-2-0 dà 49 MPN/g con un intervallo al 95 % da 15 a 150: il valore reale può trovarsi in un intervallo che copre un fattore vicino a dieci. Il BAM definisce questo intervallo così: prima di inoculare le provette, la probabilità che l'intervallo risultante contenga la concentrazione reale è almeno del 95 %. Le tabelle usano una modifica del metodo di de Man (1983); il foglio Excel della FDA usa un'approssimazione normale del logaritmo dell'MPN, quindi i suoi intervalli possono non coincidere con quelli delle tabelle.
Diversi autori hanno descritto la tendenza dell'MPN a sovrastimare la concentrazione. Il BAM cita il lavoro di Garthright (1993), che ha mostrato che questa distorsione non è apprezzabile quando i risultati sono espressi in logaritmi, la forma abituale per confrontare e combinare i dati. Per capire come si combinano incertezza, limite di rilevabilità e decisione di conformità, vedi limite di rilevabilità e incertezza di misura.
Dove si usa l'MPN nell'industria alimentare
Coliformi ed E. coli negli alimenti
Il metodo classico del BAM ha tre fasi. Nella fase presuntiva, le diluizioni si seminano in brodo lauril triptosio (LST) e si incubano a 35 °C; si registra la produzione di gas a 24 e a 48 ore. Nella fase di conferma per i coliformi, ogni provetta con gas passa in brodo lattosio bile verde brillante (BGLB) a 35 °C e, per coliformi fecali ed E. coli, in brodo EC a 44,5 °C. La fase completa per E. coli aggiunge l'isolamento su agar L-EMB e le prove biochimiche (IMViC). L'MPN si calcola con la proporzione di provette confermate in tre diluizioni consecutive. Il capitolo ricorda che coliforme non è una categoria tassonomica ma una definizione operativa. Che cosa indica ciascun gruppo nell'acqua è spiegato in coliformi totali, E. coli ed enterococchi.
E. coli nei molluschi bivalvi: ISO 16649-3
È il caso in cui l'MPN è il metodo fissato dalla norma. Il Regolamento (CE) 2073/2005 stabilisce per i molluschi bivalvi vivi, e per echinodermi, tunicati e gasteropodi marini vivi, un criterio di sicurezza per E. coli con n = 5, c = 1, m = 230 e M = 700 MPN per 100 g di polpa e liquido intervalvare, per tutta la durata di conservazione, con EN/ISO 16649-3 come metodo di riferimento. La partita è soddisfacente se tutti e cinque i valori sono pari o inferiori a 230, oppure se uno solo è compreso tra 230 e 700.
Il protocollo generico del Centro di riferimento della FAO, basato sulla ISO 16649-3, descrive il metodo come un MPN in due fasi con 5 provette e 3 diluizioni. Prima l'omogeneizzato di mollusco si semina in brodo minerale glutammato modificato e si incuba a 37 °C per 24 ore; poi le provette con produzione di acido si subcoltivano su agar con un substrato cromogenico della β-glucuronidasi (TBX) a 44 °C. Il limite teorico di rilevabilità è di 18 E. coli per 100 g e, con tre diluizioni, il risultato massimo riportabile è superiore a 18.000. I ceppi β-glucuronidasi negativi, come E. coli O157, non vengono rilevati. Lo stesso documento segnala che la norma Codex 292-2008 indica questo metodo, o uno equivalente, per i molluschi bivalvi vivi o crudi.
Salmonella quantitativa su carcasse e pelle del collo
Per Salmonella, il rilevamento (assenza in 25 g) dice se il patogeno c'è; l'MPN dice quanto ce n'è. La specifica tecnica ISO/TS 6579-2:2012 descrive un MPN miniaturizzato in piastre a 12 pozzetti: tre pozzetti per diluizione, diluizioni successive in acqua peptonata tamponata e subcoltura in terreno semisolido MSRV a 41,5 °C, con conferma su agar XLD. La norma ne riconosce il limite: il limite di rilevabilità è di circa 1 UFC/g, contro 1 UFC in 25 g (0,04 UFC/g) del metodo di rilevamento, e non è adatto a campioni con meno di 1 UFC/g, per i quali consiglia un MPN convenzionale.
Uno studio pubblicato su Poultry Science nel 2024 ha applicato questo MPN miniaturizzato a 96 campioni compositi di pelle del collo, che rappresentavano 480 carcasse di pollo. Ha trovato Salmonella nel 97,9 % dei campioni prima del raffreddamento e nell'85,4 % dopo, con conte medie di 1,84 e 1,48 log MPN/g. Un risultato di presenza non avrebbe mostrato questa riduzione. Questo tipo di quantificazione serve a valutare le fasi di processo, come si vede in Salmonella nella carne di pollo.
Listeria monocytogenes nei campioni positivi
Il capitolo 10 del BAM chiede di enumerare L. monocytogenes quando un alimento risulta positivo, usando una porzione di riserva e combinando MPN e semina diretta. L'MPN si allestisce con 50 g di campione in 450 ml di brodo di arricchimento tamponato per Listeria (BLEB) e quattro diluizioni con tre provette ciascuna, equivalenti a 10, 1, 0,1 e 0,01 g di campione. A 48 ore ogni provetta si semina per l'isolamento e la conferma, oppure si sottopone a screening con un metodo rapido approvato e si confermano i presuntivi; il risultato si interpreta con le tabelle dell'Appendice 2. Se tutte le provette sono positive, vale la conta per semina diretta.
MPN e conta in piastra (UFC) a confronto
Non sono rivali, ma strumenti per intervalli e matrici diversi:
- Sensibilità a conte basse. Il BAM segnala che l'MPN è particolarmente utile per concentrazioni basse, inferiori a 100 per grammo, soprattutto nel latte e nell'acqua. Ogni provetta può ricevere diversi grammi, il che abbassa il limite inferiore.
- Matrici difficili. Negli alimenti con particelle che interferiscono con la conta delle colonie, la provetta di brodo evita il problema di distinguere le colonie dai residui di alimento.
- Recupero delle cellule danneggiate. Il brodo funziona come una fase di crescita preliminare, che favorisce le cellule stressate da calore, freddo o disinfettanti, purché il terreno sia adeguato.
- Precisione. È il punto debole: gli intervalli dell'MPN sono ampi, per cui due risultati che sembrano diversi possono non differire statisticamente. Una piastra contata bene nel suo intervallo utile è, in generale, più precisa.
- Lavoro e tempo. Molte provette, diversi trasferimenti e conferme di 48 ore o più. La coltura tradizionale in piastra è più diretta se la carica attesa è alta.
- Conferma. Nei metodi per patogeni, una provetta con crescita è presuntiva fino alla conferma (vedi risultato presuntivo e confermato).
Quali kit TAAG si collegano a questo metodo
TAAG non ha un kit MPN: i suoi kit di PCR real-time sono qualitativi (rilevamento e identificazione) e non forniscono un numero di microrganismi per grammo. Dove possono avere un ruolo è nella lettura di provette o pozzetti, come ammette il capitolo 10 del BAM per l'MPN di Listeria. A catalogo ci sono kit per i microrganismi che si quantificano con l'MPN: Specio 1.3 E. coli (V-SF167), con matrici dichiarate di alimenti, bevande e superfici viventi e inerti; Ampliora 1.3 E. coli (V-SF69), per ortaggi a foglia e superfici; Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97), con sensibilità dichiarata di 1 UFC/25 g su coscia di pollo cruda, hamburger di bovino surgelato, salsiccia (longanicilla), mortadella e superficie; e Ampliora 2.3 Listeria spp. and L. monocytogenes (V-SF46), per alimenti, bevande e superfici. Nessuno dichiara i molluschi bivalvi come matrice convalidata, e i relativi terreni di arricchimento non sono i brodi di un MPN normalizzato (MMGM, BLEB o MSRV). Usare un kit per leggere le provette di un MPN richiede di convalidare questo impiego con il brodo e la matrice specifici; conviene valutarlo con TAAG prima di inserirlo in una procedura.
Conclusione
L'MPN stima la concentrazione di microrganismi vitali a partire da quante provette crescono in una serie di diluizioni, basandosi su una distribuzione di Poisson e su ipotesi che devono essere soddisfatte perché il valore abbia senso. Il suo punto di forza sono le conte basse, le matrici con particelle e i microrganismi che richiedono un arricchimento, ed è per questo che resta il metodo di riferimento per E. coli nei molluschi bivalvi e uno strumento utile per quantificare Salmonella o Listeria. Il suo costo è la precisione: ogni risultato va letto con il suo intervallo di confidenza, e una combinazione che non compare in tabella è un segnale d'allarme, non un numero come un altro. La scelta tra MPN e conta in piastra dipende dalla carica attesa, dalla matrice e dalla decisione che si prenderà con il risultato.
Informazioni su TAAG
Chiedi a TAAG se Specio 1.3 E. coli o Ampliora 1.1 Salmonella spp. possono essere convalidati per leggere le provette del tuo schema MPN.
Domande frequenti
Che cos'è il numero più probabile (MPN) in microbiologia?
È una stima statistica della concentrazione di microrganismi vitali. Il campione viene distribuito in più provette di brodo con diluizioni successive e, in base a quante provette mostrano crescita in ciascuna diluizione, si calcola la concentrazione che con maggiore probabilità spiega quel risultato. Si riporta come MPN per grammo, millilitro o 100 g, sempre con il suo intervallo di confidenza.
Che differenza c'è tra MPN e UFC?
Le UFC derivano dalla conta delle colonie su una piastra; l'MPN deriva da un calcolo di probabilità su provette positive e negative. L'MPN è più sensibile alle concentrazioni basse e funziona meglio nelle matrici con particelle, ma è meno preciso: i suoi intervalli di confidenza sono ampi. La conta in piastra è di solito più diretta quando la carica attesa è alta.
Quando conviene usare 5 provette invece di 3?
Più provette per diluizione danno intervalli più stretti e un limite inferiore più basso. Il BAM della FDA usa 3 provette per la maggior parte degli alimenti, ma richiede almeno 5 provette per diluizione nei molluschi bivalvi. Il metodo di riferimento per E. coli nei molluschi, ISO 16649-3, lavora con 5 provette e 3 diluizioni.
Che cosa significa un risultato come 3-1-0 o inferiore a 3 MPN/g?
Il codice indica quante provette sono risultate positive in ciascuna delle tre diluizioni. Nella tabella a 3 provette del BAM con inoculi di 0,1, 0,01 e 0,001 g, 3-1-0 equivale a 43 MPN/g (intervallo al 95 %: da 9 a 180). Se tutte le provette sono negative, il risultato si riporta come inferiore a 3,0 MPN/g, non come zero.
Una PCR può sostituire un MPN?
Non direttamente: una PCR qualitativa dice se il microrganismo è presente nella porzione analizzata, non quanti ce ne sono per grammo. Può però essere usata per leggere ogni provetta o pozzetto di un MPN, come ammette il BAM per Listeria, purché il metodo sia convalidato per quel brodo e quella matrice e i positivi siano confermati secondo la procedura.