Fa parte del pilastro tecnologia TAAG. Integra Ampliora, Elevia e Specio e come scegliere un kit TAAG.
Indice dell'articolo
Una scheda tecnica è un contratto di ambito
Prima di acquistare o introdurre un kit PCR, il laboratorio riceve una scheda tecnica con una dozzina di campi: formato, contenuto, canali di fluorescenza, tempi, sensibilità, matrici, strumenti compatibili, conservazione e, a volte, una certificazione. È la descrizione delle condizioni in cui il produttore ha dimostrato che il metodo funziona. Al di fuori di esse, il risultato non è più supportato dalla convalida.
Questo articolo passa in rassegna quei campi con esempi reali del catalogo TAAG, applicabili alla scheda di qualsiasi fornitore. Le differenze tra le linee sono in Ampliora, Elevia e Specio e la scelta per settore in come scegliere un kit TAAG.
Formato e contenuto: che cosa c'è nella confezione
Nella scheda di Ampliora 1.1 Salmonella spp. (codice V-SF97), il formato dichiarato è SPID, per 96 reazioni, e il contenuto è di 12 strip PCR precaricate, una provetta di controllo positivo da 100 µL e una provetta di controllo negativo da 352 µL. Specio 4.1 (V-SF95) è disponibile da 480 reazioni, con 60 strip precaricate e cinque provette di ciascun controllo.
Conviene controllare due aspetti:
- Che cosa è incluso e che cosa no. Ciò che non è nella confezione (terreno di arricchimento, kit di estrazione) fa comunque parte del metodo. La scheda di Ampliora 1.1 indica come prodotti correlati il terreno Augmentis 14 Universal Gram negative, il kit di estrazione Nucleia 2 Tez-Q Plus e il kit di campionamento Collectio 1 NeutroSampling. Sostituirli modifica il protocollo valutato.
- I controlli. Permettono di sapere se la corsa è valida, come spiegato in controlli di una PCR.
Chimica di rilevamento e canali di fluorescenza
Sonde o fluoroforo intercalante
Il campo della chimica indica come si genera il segnale. Le schede Ampliora dichiarano sonde fluorescenti: un oligonucleotide marcato che si ibrida all'interno della sequenza bersaglio e genera un segnale man mano che il prodotto si accumula. Holland e collaboratori hanno descritto nel 1991 questo tipo di rilevamento specifico durante l'amplificazione. Le schede Specio, invece, dichiarano un fluoroforo intercalante, che si lega a qualsiasi DNA a doppio filamento. Per questo quei kit aggiungono un'analisi della curva di melting: secondo Ririe, Rasmussen e Wittwer (1997), la forma e la posizione di questa curva dipendono dal contenuto di GC, dalla lunghezza e dalla sequenza del prodotto, e permettono di distinguere prodotti le cui temperature di melting differiscono di meno di 2 °C.
Che cosa significano FAM, HEX, ROX o Cy5
Sono i nomi dei fluorofori, e ciascuno viene letto in un canale ottico diverso del termociclatore. Un kit a sonde assegna un canale a ogni bersaglio e, quando lo prevede, un altro a un controllo. Alcuni esempi testuali dal catalogo:
- Ampliora 1.1 Salmonella spp.: FAM e HEX.
- Ampliora 3.5 (Salmonella spp., L. monocytogenes e Listeria spp.): FAM, HEX, ROX e Cy5.
- Ampliora 3.9 (STEC, E. coli O157:H7 e Salmonella spp.): FAM, HEX, ROX, Cy5 e Cy5.5.
- Specio 4.1 (Salmonella spp., L. monocytogenes, E. coli e S. aureus): solo FAM, perché la differenziazione la fa la curva di melting e non il colore.
La domanda pratica è se il tuo strumento legge quei canali. In un kit a bersaglio singolo con due canali, come Ampliora 1.1, la scheda o il foglietto illustrativo devono indicare quale canale corrisponde al microrganismo e quale a un controllo.
Termociclatori compatibili
Questo campo dice su quali strumenti sono state verificate le prestazioni. Un kit multiplex richiede che lo strumento abbia un canale ottico per ogni fluoroforo: Ampliora 3.9 ne usa cinque, quindi il termociclatore deve leggerli tutti e cinque, e la sua scheda dichiara il Bio-Rad CFX96.
Il catalogo TAAG contiene un caso che mostra perché questo campo è importante. Ampliora 3.5 (V-SF59) dichiara Agilent AriaMx e Bio-Rad CFX96, oltre a Open qPCR, con FAM, HEX, ROX e Cy5. Ampliora 3.5R (V-SF74) ricerca gli stessi tre microrganismi, ma dichiara il QuantStudio 5 Real-Time PCR System e usa FAM, VIC, ROX, TAMRA e Cy5, con un tempo di PCR di 110 minuti invece di 100. È lo stesso pannello adattato a un'altra piattaforma: non sono intercambiabili.
Se il termociclatore del laboratorio non compare nella scheda, quell'uso non è convalidato e bisogna chiedere le evidenze al produttore.
Tempo di PCR e tempo di incubazione: non sono la stessa cosa
Il tempo di PCR è quello che dice meno su quando arriva il risultato. Nella scheda di Ampliora 1.1 compare un tempo di PCR di 100 minuti e, nel campo dell'incubazione, un trattino. Non significa che non ci sia arricchimento: il kit PCR non lo comprende. L'arricchimento è nella scheda del terreno associato, Augmentis 14 Universal Gram negative, che dichiara 24 ± 2 ore di incubazione. Il terreno Augmentis 91 BPW, associato ad Ampliora 3.9, dichiara 24 ± 2 ore in generale e almeno 8 ore per i campioni di cacao.
Per stimare il tempo al risultato bisogna sommare almeno tre schede: quella del terreno, quella del kit di estrazione e quella del kit PCR, più il tempo di manipolazione. I tempi di PCR del catalogo vanno da 80 minuti (Ampliora 4.7 Low-pH Microorganisms) a 120 minuti (i kit Specio, per esempio); Elevia 1.1, su RNA, dichiara 95 minuti, come Ampliora 2.3.
Sensibilità: che cosa significa "1 UFC/25 g"
La sensibilità di un kit qualitativo è quasi sempre espressa rispetto a una porzione analitica: Ampliora 1.1, Ampliora 3.5 e Specio 4.1 dichiarano 1 UFC/25 g negli alimenti; Ampliora 3.9 ed Elevia 1.1, 1 UFC/375 g. Per le superfici, le schede di Ampliora 1.1, Ampliora 3.5, Specio 4.1 ed Elevia 1.1 esprimono la sensibilità per campione: 1 UFC/campione. Non significa che la PCR rilevi una cellula nella provetta, ma che il protocollo completo, arricchimento compreso, la rileva partendo da quella contaminazione in quella porzione. Per questo 375 g e 25 g non sono confrontabili senza guardare il protocollo di arricchimento di ciascuno.
Alcune schede distinguono due sensibilità. Ampliora 4.3 Yeast dichiara 1x10⁰ UFC/mL nel campione arricchito e 1x10³ cellule/mL nel campione diretto: sono due valori diversi da non confondere. E i pannelli WaterScan esprimono la sensibilità come un intervallo, da 5x10⁰ a 5x10¹ UFC/mL.
LOD, LOD50 e RLOD
In un metodo qualitativo, il rilevamento a livelli molto bassi è probabilistico: con poche cellule per porzione, alcune porzioni le contengono e altre no. La ISO 16140-2 confronta il livello di rilevabilità del metodo alternativo con quello del metodo di riferimento mediante l'RLOD, definito come il rapporto tra i due LOD. Lo studio usa campioni contaminati artificialmente ad almeno tre livelli; il livello basso si colloca idealmente al livello teorico di rilevabilità, 0,7 UFC per porzione, e deve dare tra il 25 % e il 75 % di positivi con il metodo di riferimento. Il limite di accettabilità è 1,5 negli studi appaiati e 2,5 in quelli non appaiati; un LOD inferiore a quello di riferimento è sempre accettato. L'AOAC, da parte sua, esprime le prestazioni come probabilità di rilevamento (POD): la proporzione di risultati positivi per una data matrice e un dato livello di analita. Il LOD50 e la sua incertezza sono approfonditi in limite di rilevabilità e LOD50.
Inclusività ed esclusività: la specificità in numeri
Una scheda può dire "rilevamento di Salmonella spp.", ma questa frase si basa su uno studio concreto:
- Inclusività. La capacità del metodo di rilevare il microrganismo bersaglio in un'ampia gamma di ceppi. La ISO 16140-2 richiede almeno 50 colture pure del bersaglio e, per i metodi per Salmonella, almeno 100 colture di sierotipi diversi. Ogni ceppo viene inoculato a un livello da 10 a 100 volte il livello minimo di rilevabilità del metodo e processato con il protocollo completo, arricchimento compreso.
- Esclusività. L'assenza di interferenza da parte di ceppi non bersaglio pertinenti. La ISO 16140-2 richiede almeno 30 colture pure non bersaglio. L'AOAC la definisce come uno studio con ceppi non bersaglio potenzialmente reattivi che non devono essere rilevati.
La norma chiede inoltre di scegliere i ceppi in base al principio di misura del metodo. Leggendo una scheda, la domanda utile è con quanti ceppi e sierotipi è stato dimostrato il rilevamento e rispetto a quali non bersaglio. Questo dato si trova di solito nel rapporto di convalida, non nella scheda riassuntiva, ed è ragionevole richiederlo.
Matrici convalidate: il campo che definisce l'ambito reale
Le matrici delle schede TAAG sono concrete. Ampliora 1.1 dichiara coscia di pollo cruda, hamburger di bovino surgelato, salsiccia (longanicilla), mortadella e superficie. Ampliora 3.9 dichiara cavolo, lattuga, spinaci, una miscela di foglie verdi (lattuga, cavolo e spinaci in parti uguali) e carne macinata di bovino cruda (80 % magra). Specio 4.1 elenca una lunga serie di alimenti preparati, carni, latticini, uovo liquido pastorizzato e superfici viventi e inerti, e le sue matrici AOAC sono superfici in acciaio inossidabile, latte liquido pastorizzato al 2 % di grassi e ortaggi a foglia (lattuga). Elevia 1.1 dichiara cioccolatino ripieno di tipo nocciola, cioccolatino ripieno di tipo latte, barretta di cioccolato con arachidi, crema di nocciole e cacao, carne in muscolo intero, carne bovina macinata (90 % magra), pellet di mangime per animali, uova liquide pastorizzate e superfici in acciaio inossidabile.
Questo è importante per due motivi. Il primo è l'inibizione: una revisione dell'Istituto federale tedesco per la valutazione del rischio (Schrader e collaboratori, 2012) descrive come le sostanze inibenti presenti nel campione possano ridurre la sensibilità della PCR o produrre falsi negativi, e come alcune siano tipiche di determinati tipi di campione, il che impone protocolli di estrazione specifici per matrice. Il secondo è la flora di accompagnamento e lo stato delle cellule: la ISO 16140-2 chiede che una convalida includa prodotti con flora di fondo alta e bassa, diversi stress di processo e prodotti crudi.
La norma fissa anche l'ambito: se un metodo è dichiarato per una "ampia gamma di alimenti", devono essere studiate almeno cinque categorie, con almeno tre tipi per categoria. Il Regolamento (CE) 2073/2005 ammette metodi alternativi convalidati rispetto al metodo di riferimento e, se proprietari, certificati da terzi secondo la ISO 16140 o altri protocolli internazionali analoghi. Se il tuo prodotto non compare tra le matrici, la scheda non dice che il kit non funziona: dice che nessuno lo ha ancora dimostrato. La verifica nel proprio laboratorio, secondo la ISO 16140-3, è spiegata in validazione e verifica dei metodi.
Conservazione e durata
Tutti i kit PCR del catalogo TAAG si conservano tra -25 °C e -15 °C. La durata dichiarata è di 9 mesi per la maggior parte (per esempio Ampliora 1.1, Ampliora 3.9 e Specio 4.1) e di 6 mesi per i kit Elevia. I terreni e i reagenti hanno condizioni proprie: Augmentis 14 si conserva tra 2 °C e 25 °C con 6 mesi di durata, e Nucleia 2 Tez-Q Plus tra 2 °C e 25 °C con 12 mesi. La durata più breve dell'insieme condiziona gli acquisti.
Certificazioni e versione della scheda
Ampliora 3.9 dichiara "Certified by AOAC by extension of License Number 032501" e Specio 4.1 "Certified by AOAC by extension of License Number 072101". La scheda di Elevia 1.1 pubblicata su taag.bio aggiunge "Certified by AOAC by extension of License Number 072601", con un ambito PTM su cioccolato al 62 % di cacao, liquore di cacao, latte scremato in polvere e arachidi (375 g ciascuno) e superfici in acciaio inossidabile da 100 cm², senza il protocollo "zero". L'ambito certificato e l'elenco delle matrici convalidate sono campi distinti e non devono necessariamente coincidere. La parola "extension" indica che è stato ampliato l'ambito di una licenza esistente, e ogni certificazione copre le matrici e i bersagli valutati in quello studio, come spiegato in che cos'è la certificazione AOAC-PTM. In un audit bisogna incrociare il numero di licenza, le matrici certificate e la matrice reale del laboratorio.
Le schede hanno anche un numero e una data di revisione. Quella di Ampliora 1.1, per esempio, è alla revisione 4, del 7 ottobre 2025. Conviene archiviare la versione in vigore insieme alle registrazioni di verifica.
Quali kit e tecnologie TAAG compaiono in questo articolo
Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97) e Ampliora 3.9 (V-SF68) sono PCR real-time con sonde fluorescenti progettate con Mila; Specio 4.1 (V-SF95) usa un fluoroforo intercalante con curva di melting interpretata con KAi; Elevia 1.1 Salmonella spp. (V-PAT04) è una RT-qPCR su RNA con tecnologia AiGOR. In tutti e quattro i casi, la scheda indica che il software TxA interpreta le curve in modo automatico. Se la matrice o lo strumento del laboratorio non coincidono con quelli dichiarati, occorre una verifica prima di usare il risultato.
Conclusione
La scheda tecnica di un kit PCR descrive le condizioni in cui il metodo è stato dimostrato: con quale terreno e quale estrazione, su quale strumento e con quali canali, per quale porzione e quali matrici, e con quale studio di inclusività, esclusività e livello di rilevabilità. Leggerla bene significa separare il tempo di PCR dal tempo totale, capire che la sensibilità si riferisce a una porzione e a un protocollo completo, e incrociare le matrici e la certificazione con ciò che il laboratorio analizza davvero. Quando qualcosa non coincide, la scheda non dice che il kit non funziona, ma che occorre verificarlo prima di decidere sulla base del suo risultato.
Informazioni su TAAG
Esamina con TAAG la scheda tecnica di Ampliora 1.1 Salmonella spp., Ampliora 3.9 o Specio 4.1 rispetto alla tua matrice e al tuo termociclatore.
Domande frequenti
Il tempo di PCR della scheda è il tempo totale fino al risultato?
No. Il tempo di PCR corrisponde solo alla corsa nel termociclatore. Al tempo totale vanno aggiunti l'arricchimento, indicato nella scheda del terreno di coltura (per esempio 24 ± 2 ore per Augmentis 14 Universal Gram negative), l'estrazione e la manipolazione.
Che cosa significa una sensibilità di 1 UFC/25 g?
Che il protocollo completo, con il suo arricchimento, rileva il microrganismo partendo da quella contaminazione in una porzione di 25 g. Non vuol dire che la PCR rilevi una sola cellula nella provetta, e il rilevamento a livelli così bassi è probabilistico, per cui le norme lo valutano con LOD50, RLOD o POD.
Che cosa sono l'inclusività e l'esclusività di un kit?
L'inclusività è la capacità di rilevare il microrganismo bersaglio in molti ceppi diversi; la ISO 16140-2 richiede almeno 50 ceppi, e 100 sierotipi nel caso di Salmonella. L'esclusività è il fatto che il metodo non risponda a ceppi non bersaglio pertinenti; la norma ne richiede almeno 30.
Posso usare un kit su una matrice che non compare nella scheda?
Puoi, ma quell'uso non è supportato dalla convalida del produttore. Prima di usare il risultato per decidere, il laboratorio deve verificare il metodo sulla propria matrice, per esempio secondo la ISO 16140-3, perché l'inibizione della PCR e la flora di accompagnamento cambiano da un alimento all'altro.
Un kit funziona su qualsiasi termociclatore real-time?
Non necessariamente. Lo strumento deve leggere i canali di fluorescenza usati dal kit ed essere tra quelli su cui sono state verificate le prestazioni. Nel catalogo TAAG, Ampliora 3.5 e Ampliora 3.5R ricercano gli stessi microrganismi ma dichiarano piattaforme e fluorofori diversi.