Este artículo complementa qué son las UFC y el cultivo microbiológico tradicional: explica el otro gran método de recuento, el que trabaja con tubos y probabilidades.
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Contar sin ver colonias
El recuento en placa cuenta lo que se ve: cada colonia sobre el agar se asume como una unidad formadora de colonia, como se explica en qué son las UFC y cómo se interpretan. El método del Número Más Probable (NMP, o MPN por su sigla en inglés) llega a una cifra por otro camino. No cuenta colonias: reparte la muestra en varios tubos con caldo, observa cuáles muestran crecimiento y, a partir de esa combinación de positivos y negativos, calcula la concentración que con mayor probabilidad produjo ese resultado.
El Apéndice 2 del Manual Analítico Bacteriológico (BAM) de la FDA atribuye a McCrady, en 1915, la primera estimación precisa de bacterias viables por esta vía. Sigue vigente porque resuelve situaciones en las que la placa falla: concentraciones bajas, alimentos con partículas que se confunden con colonias y microorganismos que necesitan un enriquecimiento antes de poder aislarse.
El principio estadístico
La idea es diluir hasta que algunos tubos reciban al menos una célula viable y otros ninguna. Si las bacterias están repartidas al azar, el número de células que cae en cada tubo sigue una distribución de Poisson, y la probabilidad de que un tubo quede sin células depende solo de la concentración y de la cantidad de muestra inoculada. Con varias diluciones decimales y varios tubos por dilución, el patrón de tubos positivos permite estimar la concentración original. El NMP es, literalmente, el valor de concentración que hace más probable el resultado observado; la ecuación se resuelve por iteración.
Los supuestos que deben cumplirse
El BAM enumera cuatro condiciones para que la estimación sea válida:
- Las bacterias están distribuidas al azar en la muestra.
- Están separadas, no agrupadas, y no se repelen entre sí.
- Todo tubo que recibe aunque sea un organismo viable produce crecimiento o un cambio detectable.
- Los tubos son independientes entre sí.
El tercer supuesto es el más exigente: el medio debe permitir crecer a una sola célula, a veces dañada, frente a la flora acompañante. Por eso la calidad del caldo y de la etapa de enriquecimiento condiciona directamente el resultado. Además, el NMP solo cuenta organismos viables. Si las bacterias forman cadenas o grupos que la dilución no separa, el BAM indica que el resultado debe leerse como unidades de crecimiento o UFC, no como células individuales.
Series de 3, 5 y 10 tubos
El diseño más publicado son tres diluciones decimales consecutivas con 3, 5, 8 o 10 tubos cada una; el Apéndice 2 trae tablas para esos diseños, construidas para inóculos de 0,1, 0,01 y 0,001 g. El capítulo 4 del BAM, sobre coliformes y E. coli, indica que la serie de 3 tubos se usa para la mayoría de los alimentos; que en moluscos bivalvos no deben usarse menos de 5 tubos por dilución; y que existe un método de 10 tubos para agua embotellada o muestras que no se espera estén muy contaminadas.
Más tubos significan más información por dilución y, por lo tanto, intervalos más estrechos y un límite inferior más bajo. Con las tablas del BAM y los inóculos de 0,1, 0,01 y 0,001 g, el resultado con todos los tubos negativos se informa como menor que 3,0 NMP/g en la serie de 3 tubos y como menor que 1,8 NMP/g en la de 5 tubos. El límite superior del intervalo de confianza de ese resultado nulo baja de 9,5 a 6,8 y, con 10 tubos, a 3,1 NMP/g.
Cómo se leen las tablas
El resultado se expresa como un código de tres cifras: el número de tubos positivos en cada una de las tres diluciones elegidas. En la tabla de 3 tubos, el código 3-1-0 corresponde a 43 NMP/g, con un intervalo de confianza del 95 % de 9 a 180. Si los inóculos usados fueron diez veces menores que los de la tabla (0,01, 0,001 y 0,0001 g), el valor y sus límites se multiplican por 10: 430 NMP/g. La misma regla funciona hacia abajo: inocular cantidades mayores baja el límite de cuantificación.
Cuando se siembran más de tres diluciones, el BAM describe un procedimiento para elegir las tres que se llevan a la tabla. En síntesis, se descartan las diluciones más altas que, junto con la anterior, tengan todos los tubos negativos, y se busca la dilución más alta con todos los tubos positivos. La FDA ofrece además una aplicación de cálculo y una planilla para seleccionar diluciones.
Las tablas omiten combinaciones tan improbables que sugieren error de laboratorio o contaminación. Si el código obtenido no está en la tabla, el BAM lo trata como un resultado improbable: puede deberse a interferencias en las diluciones bajas o a confirmar pocas colonias, y si la causa no se conoce, la estimación puede no ser confiable.
Intervalos de confianza: la cifra viene con un rango amplio
Un NMP siempre debe leerse junto con su intervalo. En la serie de 5 tubos, el código 5-2-0 da 49 NMP/g con un intervalo del 95 % de 15 a 150: el valor real puede estar en un rango que cubre un factor cercano a diez. El BAM define ese intervalo así: antes de inocular los tubos, la probabilidad de que el intervalo resultante contenga la concentración real es de al menos 95 %. Las tablas usan una modificación del método de de Man (1983); la planilla Excel de la FDA usa una aproximación normal al logaritmo del NMP, así que sus intervalos pueden no coincidir con los de las tablas.
Varios autores han descrito que el NMP tiende a sobrestimar la concentración. El BAM cita el trabajo de Garthright (1993), que mostró que ese sesgo no es apreciable cuando los resultados se expresan en logaritmos, la forma habitual de comparar y combinar datos. Para entender cómo se combinan la incertidumbre, el límite de detección y la decisión de cumplimiento, ver límite de detección e incertidumbre de medición.
Dónde se usa el NMP en la industria alimentaria
Coliformes y E. coli en alimentos
El método clásico del BAM tiene tres fases. En la presuntiva, las diluciones se siembran en caldo lauril triptosa (LST) y se incuban a 35 °C; se registra la producción de gas a las 24 y a las 48 horas. En la confirmativa para coliformes, cada tubo con gas pasa a caldo verde brillante bilis lactosa (BGLB) a 35 °C, y para coliformes fecales y E. coli, a caldo EC a 44,5 °C. La fase completa para E. coli agrega aislamiento en agar L-EMB y pruebas bioquímicas (IMViC). El NMP se calcula con la proporción de tubos confirmados en tres diluciones consecutivas. El capítulo recuerda que coliforme no es una categoría taxonómica sino una definición de trabajo. Qué indica cada grupo en agua se explica en coliformes totales, E. coli y enterococos.
E. coli en moluscos bivalvos: ISO 16649-3
Es el caso en que el NMP es el método que fija la norma. El Reglamento (CE) 2073/2005 establece para moluscos bivalvos vivos, y para equinodermos, tunicados y gasterópodos marinos vivos, un criterio de seguridad de E. coli con n = 5, c = 1, m = 230 y M = 700 NMP por 100 g de carne y líquido intervalvar, durante la vida útil, con EN/ISO 16649-3 como método de referencia. El lote es satisfactorio si los cinco valores son 230 o menos, o si uno solo está entre 230 y 700.
El protocolo genérico del Centro de Referencia de la FAO, basado en ISO 16649-3, describe el método como un NMP de dos etapas con 5 tubos y 3 diluciones. Primero, el homogeneizado de molusco se siembra en caldo glutamato con minerales modificado y se incuba a 37 °C durante 24 horas; luego, los tubos con producción de ácido se subcultivan en agar con un sustrato cromogénico de β-glucuronidasa (TBX) a 44 °C. El límite teórico de detección es de 18 E. coli por 100 g, y con tres diluciones el resultado máximo informable es mayor que 18.000. Las cepas β-glucuronidasa negativas, como E. coli O157, no se detectan. El mismo documento señala que la norma Codex 292-2008 identifica este método, o uno equivalente, para moluscos bivalvos vivos o crudos.
Salmonella cuantitativa en canales y piel de cuello
Para Salmonella, la detección (ausencia en 25 g) responde si el patógeno está; el NMP responde cuánto hay. La especificación técnica ISO/TS 6579-2:2012 describe un NMP miniaturizado en placas de 12 pocillos: tres pocillos por dilución, diluciones sucesivas en agua de peptona tamponada y subcultivo en medio semisólido MSRV a 41,5 °C, con confirmación en agar XLD. La norma reconoce su límite: el límite de detección es de aproximadamente 1 UFC/g, frente a 1 UFC en 25 g (0,04 UFC/g) del método de detección, y no es apropiado para muestras con menos de 1 UFC/g, en las que aconseja un NMP convencional.
Un estudio publicado en Poultry Science en 2024 aplicó este NMP miniaturizado a 96 muestras compuestas de piel de cuello, que representaban 480 canales de pollo. Encontró Salmonella en 97,9 % de las muestras antes del enfriamiento y en 85,4 % después, con recuentos medios de 1,84 y 1,48 log NMP/g. Un resultado de presencia no habría mostrado esa reducción. Este tipo de cuantificación sirve para evaluar etapas de proceso, como se ve en Salmonella en carne de pollo.
Listeria monocytogenes en muestras positivas
El capítulo 10 del BAM pide enumerar L. monocytogenes cuando un alimento da positivo, usando una porción de reserva y combinando NMP y siembra directa. El NMP se arma con 50 g de muestra en 450 ml de caldo de enriquecimiento para Listeria tamponado (BLEB) y cuatro diluciones con tres tubos cada una, equivalentes a 10, 1, 0,1 y 0,01 g de muestra. A las 48 horas cada tubo se siembra para aislamiento y confirmación, o se tamiza con un método rápido aprobado y se confirman los presuntivos; el resultado se interpreta con las tablas del Apéndice 2. Si todos los tubos son positivos, vale el recuento por siembra directa.
NMP frente a recuento en placa (UFC)
No son rivales, sino herramientas para rangos y matrices distintas:
- Sensibilidad en recuentos bajos. El BAM señala que el NMP es particularmente útil para concentraciones bajas, menores de 100 por gramo, sobre todo en leche y agua. Cada tubo puede recibir varios gramos, lo que baja el límite inferior.
- Matrices difíciles. En alimentos con partículas que interfieren con el recuento de colonias, el tubo con caldo evita el problema de distinguir colonias de restos de alimento.
- Recuperación de células dañadas. El caldo funciona como una etapa de crecimiento previa, lo que favorece a células estresadas por calor, frío o desinfectantes, siempre que el medio sea el adecuado.
- Precisión. Es el punto débil: los intervalos del NMP son amplios, de modo que dos resultados que parecen distintos pueden no diferir estadísticamente. Una placa bien contada en su rango útil es, en general, más precisa.
- Trabajo y tiempo. Muchos tubos, varias transferencias y confirmaciones de 48 horas o más. El cultivo tradicional en placa es más directo si la carga esperada es alta.
- Confirmación. En los métodos de patógenos, un tubo con crecimiento es presuntivo hasta confirmarse (ver resultado presuntivo vs. confirmado).
Qué kits de TAAG se relacionan con este método
TAAG no tiene un kit de NMP: sus kits de PCR en tiempo real son cualitativos (detección e identificación) y no entregan un número de microorganismos por gramo. Donde pueden tener un rol es en la lectura de tubos o pocillos, como admite el capítulo 10 del BAM para el NMP de Listeria. En el catálogo hay kits para los microorganismos que se cuantifican por NMP: Specio 1.3 E. coli (V-SF167), con matrices declaradas de alimentos, bebidas y superficies vivas e inertes; Ampliora 1.3 E. coli (V-SF69), para hortalizas de hoja y superficies; Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97), con sensibilidad declarada de 1 UFC/25 g en muslo de pollo crudo, hamburguesa de res congelada, salchicha (longanicilla), mortadela y superficie; y Ampliora 2.3 Listeria spp. and L. monocytogenes (V-SF46), para alimentos, bebidas y superficies. Ninguno declara moluscos bivalvos como matriz validada, y sus medios de enriquecimiento asociados no son los caldos de un NMP normalizado (MMGM, BLEB o MSRV). Usar un kit para leer tubos de un NMP requiere validar ese uso con el caldo y la matriz concretos; conviene revisarlo con TAAG antes de incorporarlo a un procedimiento.
Conclusión
El NMP estima la concentración de microorganismos viables a partir de cuántos tubos crecen en una serie de diluciones, apoyándose en una distribución de Poisson y en supuestos que deben cumplirse para que la cifra tenga sentido. Su fortaleza está en los recuentos bajos, en las matrices con partículas y en los microorganismos que necesitan enriquecimiento, y por eso sigue siendo el método de referencia para E. coli en moluscos bivalvos y una herramienta útil para cuantificar Salmonella o Listeria. Su costo es la precisión: cada resultado debe leerse con su intervalo de confianza, y una combinación que no aparece en la tabla es una señal de alerta, no un número más. Elegir entre NMP y recuento en placa depende de la carga esperada, la matriz y la decisión que se va a tomar con el resultado.
Sobre TAAG
Consulta con TAAG si Specio 1.3 E. coli o Ampliora 1.1 Salmonella spp. pueden validarse para leer los tubos de tu esquema de NMP.
Preguntas frecuentes
¿Qué es el Número Más Probable (NMP) en microbiología?
Es una estimación estadística de la concentración de microorganismos viables. La muestra se reparte en varios tubos de caldo con diluciones sucesivas y, según cuántos tubos muestran crecimiento en cada dilución, se calcula la concentración que con mayor probabilidad explica ese resultado. Se informa como NMP por gramo, mililitro o 100 g, siempre con su intervalo de confianza.
¿Qué diferencia hay entre NMP y UFC?
Las UFC salen de contar colonias en una placa; el NMP sale de un cálculo de probabilidad sobre tubos positivos y negativos. El NMP es más sensible para concentraciones bajas y funciona mejor en matrices con partículas, pero es menos preciso: sus intervalos de confianza son amplios. El recuento en placa suele ser más directo cuando la carga esperada es alta.
¿Cuándo conviene usar 5 tubos en lugar de 3?
Más tubos por dilución dan intervalos más estrechos y un límite inferior más bajo. El BAM de la FDA usa 3 tubos para la mayoría de los alimentos, pero exige al menos 5 tubos por dilución en moluscos bivalvos. El método de referencia para E. coli en moluscos, ISO 16649-3, trabaja con 5 tubos y 3 diluciones.
¿Qué significa un resultado como 3-1-0 o menor que 3 NMP/g?
El código indica cuántos tubos fueron positivos en cada una de las tres diluciones. En la tabla de 3 tubos del BAM con inóculos de 0,1, 0,01 y 0,001 g, 3-1-0 equivale a 43 NMP/g (intervalo del 95 %: 9 a 180). Si todos los tubos son negativos, el resultado se informa como menor que 3,0 NMP/g, no como cero.
¿Una PCR puede reemplazar un NMP?
No directamente: una PCR cualitativa responde si el microorganismo está en la porción analizada, no cuántos hay por gramo. Sí puede usarse para leer cada tubo o pocillo de un NMP, como admite el BAM para Listeria, siempre que el método esté validado para ese caldo y esa matriz y que los positivos se confirmen según el procedimiento.