Este artículo complementa qué es la PCR y extracción de ácidos nucleicos, donde se presentan los inhibidores de PCR.
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El problema del negativo silencioso
Un resultado positivo de PCR deja una huella visible: una curva de fluorescencia que sube. Un negativo, en cambio, es la ausencia de esa curva. Y la ausencia de señal tiene más de una explicación posible: que el microorganismo no esté en la muestra, o que la reacción no haya funcionado. Una polimerasa inhibida por componentes del alimento, un error de pipeteo, una extracción fallida o un equipo con problemas producen exactamente la misma imagen que una muestra limpia.
Por eso una PCR sin controles no permite distinguir un verdadero negativo de un falso negativo. En microbiología de alimentos esa diferencia importa mucho: un falso negativo de Salmonella o Listeria monocytogenes significa liberar un producto contaminado con un informe que dice lo contrario.
El marco de referencia: ISO 22174 y MIQE
La norma ISO 22174 establece los requisitos generales para la amplificación de ácidos nucleicos (ADN o RNA) en la detección de microorganismos y virus de la cadena alimentaria. Su segunda edición, de 2024, reemplazó a la versión de 2005 y a otras tres normas de PCR (ISO 20837, ISO 20838 e ISO 22119), incorporó requisitos para PCR digital y para el monitoreo de los flujos de trabajo del laboratorio, y amplió la sección sobre reacciones de control con la descripción de los distintos controles.
En paralelo, las guías MIQE (Información Mínima para la Publicación de Experimentos de PCR Cuantitativa en Tiempo Real), revisadas como MIQE 2.0 en 2025, fijan qué información de controles, diseño del ensayo y análisis de datos debe documentarse para que un resultado de qPCR sea reproducible. Aunque nacieron para publicaciones científicas, son una buena lista de verificación para cualquier laboratorio.
Los controles que hacen interpretable una corrida
Control interno de amplificación (IAC)
Es una secuencia de ADN que no pertenece al microorganismo objetivo y que se agrega en el mismo tubo que la muestra, para amplificarse al mismo tiempo. Si el IAC amplifica, la reacción funcionó en ese tubo; si no amplifica, algo la impidió. Hoorfar y colaboradores (2004) lo resumen así: el IAC permite distinguir un verdadero negativo de una falla de la PCR causada por inhibidores, por el equipo o por una actividad deficiente de la polimerasa. Los mismos autores señalan que la norma EN ISO 22174 exige su presencia en la detección de patógenos transmitidos por alimentos por PCR.
Hay dos estrategias de diseño:
- IAC competitivo: comparte los sitios de unión de los primers con el blanco. Evita problemas de interferencia entre primers, pero compite por los reactivos y puede reducir la sensibilidad.
- IAC no competitivo: usa su propio par de primers. Requiere una optimización cuidadosa para que la competencia por reactivos y polimerasa no afecte la detección del blanco, algo parecido al desafío de diseño de la PCR multiplex.
La concentración del IAC es crítica. Los autores recomiendan mantenerla tan baja como sea posible, siempre que siga generando señal: un IAC en exceso puede tolerar una inhibición parcial que sí afecta a un blanco presente en bajo número de copias, y además quitarle recursos a la reacción.
Control positivo
Una reacción con el material genético del microorganismo objetivo que demuestra que los primers, las sondas, los reactivos y el programa de temperaturas detectan lo que deben detectar en esa corrida.
Control negativo y control sin molde (NTC)
El control sin molde contiene todos los reactivos pero ningún ácido nucleico. Si amplifica, hay contaminación de reactivos o arrastre de amplicones de corridas anteriores, y los positivos de esa corrida pierden credibilidad. Un control negativo de extracción, procesado junto con las muestras desde el inicio, amplía esa vigilancia a toda la etapa de preparación.
Controles de proceso
Algunos protocolos agregan un control que acompaña a la muestra desde el enriquecimiento o la extracción, para verificar que todo el proceso (no solo la amplificación) funcionó. Es especialmente útil en matrices nuevas o difíciles.
Cómo se lee la combinación de señales
Con un IAC en cada tubo, la interpretación de una muestra se ordena en tres casos, siguiendo el esquema de Hoorfar y colaboradores:
- Amplifica el IAC y no el blanco: negativo válido. La reacción funcionaba y el blanco no estaba.
- Amplifica el blanco y no el IAC: positivo válido. Cuando el blanco está en gran cantidad, puede desplazar al IAC en la competencia por reactivos.
- No amplifica ninguno: resultado inválido. Lo más probable es una inhibición o una falla de la reacción; no puede informarse como negativo.
Todo esto vale solo si los controles de la corrida se comportaron como se esperaba: el control positivo amplificó y el control sin molde quedó limpio. Si alguno falla, la corrida completa se revisa antes de interpretar cualquier muestra.
Inhibición: de dónde viene y qué hacer
La revisión de Schrader y colaboradores (2012) describe los inhibidores de PCR como un grupo diverso de sustancias con propiedades y mecanismos distintos, algunas típicas de ciertos tipos de muestra, que pueden reducir la sensibilidad del ensayo o producir falsos negativos. En alimentos, las matrices con mucha grasa, proteína, polisacáridos o polifenoles, como el chocolate o las especias, son las que más a menudo exigen protocolos de preparación específicos. Los autores recomiendan evaluar la influencia de los inhibidores en cada ensayo en particular, no suponer que un protocolo sirve para todas las matrices.
Cuando el IAC indica inhibición, las respuestas habituales son:
- Diluir el extracto y repetir: el BAM de la FDA indica que, ante resultados de screening sospechosos de inhibición, debe repetirse el análisis con el ADN molde diluido. La dilución reduce el inhibidor más de lo que reduce la sensibilidad, siempre que el blanco no esté cerca del límite de detección.
- Mejorar la extracción: usar un protocolo pensado para matrices con alta carga de inhibidores.
- Pasar al método de cultivo: el BAM establece que, si los métodos moleculares dan resultados indeterminados, el método de cultivo se completa, y que si una muestra fortificada (matrix spike) da negativo en el screening, el análisis debe continuar por cultivo.
Contaminación: el riesgo inverso
El otro error clásico es el falso positivo por contaminación. Una PCR genera millones de copias del fragmento amplificado, y una cantidad invisible de ese producto en una pipeta, un guante o una superficie puede contaminar la siguiente corrida. Por eso los laboratorios separan físicamente las áreas de preparación de reactivos, de extracción y de amplificación, con flujo en un solo sentido. La edición 2024 de ISO 22174 incorporó justamente requisitos para el monitoreo de esos flujos, incluido el monitoreo ambiental del propio laboratorio de PCR. El control sin molde es la alarma de primera línea: si amplifica, la corrida no es confiable.
Controles e interpretación automatizada
En un laboratorio que procesa cientos de reacciones por día, revisar a mano cada IAC, cada control positivo y cada NTC es lento y abre espacio a errores. Por eso el software de interpretación, como TxA en los kits de TAAG, aplica las reglas de validez de forma sistemática antes de asignar un resultado. La automatización no reemplaza al diseño de controles, pero asegura que las reglas se apliquen igual en todas las corridas y turnos.
Y aun con todos los controles en orden, un positivo de screening sigue siendo presuntivo en la mayoría de los esquemas regulatorios. Lo que ocurre después lo explicamos en resultado presuntivo vs. confirmado.
Conclusión
Un negativo de PCR solo tiene valor si la reacción demostró que podía dar positivo. El control interno de amplificación en cada tubo, junto con los controles positivo, negativo y sin molde de cada corrida, permite separar un verdadero negativo de una inhibición y un verdadero positivo de una contaminación. ISO 22174, en su edición 2024, y las guías MIQE 2.0 ofrecen el marco para diseñar esos controles; la dilución del extracto y el paso a cultivo son las salidas cuando la matriz inhibe la reacción.
Sobre TAAG
Consulta con TAAG qué controles incorporan sus kits y cómo TxA aplica las reglas de validez al interpretar cada corrida.
Preguntas frecuentes
¿Qué es un control interno de amplificación (IAC)?
Es una secuencia de ADN ajena al microorganismo objetivo que se amplifica en el mismo tubo que la muestra. Si amplifica, la reacción funcionó; si no amplifica y el blanco tampoco, el resultado es inválido, probablemente por inhibición.
¿Por qué un positivo puede tener el IAC sin amplificar?
Porque cuando el blanco está en gran cantidad puede desplazar al IAC en la competencia por los reactivos de la reacción. En ese caso el resultado se considera positivo válido.
¿Qué hacer si una muestra muestra inhibición?
El BAM de la FDA indica repetir el screening con el ADN molde diluido. Si los resultados moleculares siguen siendo indeterminados, el análisis se completa por el método de cultivo.
¿Qué indica una señal en el control sin molde (NTC)?
Que hay contaminación en los reactivos o arrastre de material amplificado. Los positivos de esa corrida no son confiables y la corrida debe revisarse.