Parte del pilar de métodos de laboratorio. Si todavía no leíste qué pasa después de un positivo, empieza por resultado presuntivo vs. confirmado.
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El cuello de botella de la identificación
En un laboratorio de alimentos, detectar una colonia sospechosa es solo la mitad del trabajo. La otra mitad es saber qué es. Durante décadas esa pregunta se respondió con baterías de pruebas bioquímicas, galerías comerciales y serología, que pueden demandar uno o dos días adicionales por aislado. La espectrometría de masas MALDI-TOF cambió ese tramo del análisis: a partir de una colonia pura, entrega una identificación en minutos.
Este artículo explica cómo funciona la técnica, dónde encaja en el flujo de un laboratorio de alimentos, cómo se valida para confirmar patógenos y qué preguntas no puede responder.
Qué significa MALDI-TOF
La sigla describe las dos partes del proceso. MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) es la forma de convertir las moléculas de la muestra en iones: el material microbiano se mezcla con una matriz química que absorbe la energía de un láser y la transfiere a las proteínas, que se desprenden y quedan cargadas. TOF (time of flight) es la forma de medirlas: los iones se aceleran en un tubo al vacío y llegan al detector en un tiempo que depende de su relación entre masa y carga. Los más livianos llegan antes.
El resultado es un espectro: una serie de picos que funciona como una huella dactilar de proteínas. Según la revisión de Singhal y colaboradores (2015), la identificación se basa en el patrón de proteínas ribosomales muy abundantes, en el rango de 2 a 20 kDa. Como esas proteínas cambian poco dentro de una especie y difieren entre especies, el perfil permite reconocer al microorganismo.
Cómo es el flujo en el laboratorio
1. Partir de una colonia pura
MALDI-TOF no trabaja sobre el alimento ni sobre el caldo de enriquecimiento. Necesita un aislado: una colonia crecida en placa, idealmente separada de otras. Singhal y colaboradores señalan que la técnica no puede identificar organismos directamente a partir de poblaciones mezcladas. Por eso MALDI-TOF viene después del cultivo en placa, no en lugar de él.
2. Preparar la muestra
Hay tres niveles de preparación, que se eligen según el tipo de microorganismo:
- Transferencia directa: se extiende una porción mínima de la colonia sobre la placa metálica del equipo y se cubre con la matriz. Singhal y colaboradores indican que funciona bien para muchas bacterias gramnegativas.
- Transferencia directa con ácido fórmico: se agrega una gota de ácido fórmico antes de la matriz para ayudar a romper paredes celulares más resistentes. Según la misma revisión, mejora la identificación de bacterias grampositivas y de hongos.
- Extracción completa: un protocolo con etanol y ácido fórmico que libera las proteínas antes de depositarlas. Microorganismos como las micobacterias requieren procedimientos específicos adicionales.
3. Adquirir el espectro y compararlo
El equipo genera el espectro y el software lo compara con una base de datos de espectros de referencia. El resultado es una identificación acompañada de una puntuación de coincidencia; cada sistema define los rangos de puntuación que considera confiables a nivel de género o de especie. Una puntuación baja no es una identificación, y el procedimiento del laboratorio debe decir qué hacer en ese caso: repetir con extracción, subcultivar o recurrir a otro método.
La edad del cultivo importa
Un detalle que suele pasarse por alto es que el perfil de proteínas cambia con el estado fisiológico de la célula. Janiszewska y colaboradores (2023) estudiaron la identificación de especies de Bacillus formadoras de esporas aisladas de leche de vaca, chucrut y pepinos encurtidos. Encontraron que el tiempo de incubación óptimo variaba entre 1 y 12 horas según la cepa, con menor presencia de esporas entre las 5 y las 8 horas, y que tras 24 horas de incubación solo alrededor del 47 % de las muestras se identificaba con éxito. En ese estudio, la transferencia directa y la extracción dieron resultados comparables.
La lección práctica es que, para microorganismos esporulados, una placa "vieja" puede dar puntuaciones bajas aunque el equipo y la base de datos funcionen bien. Es relevante al trabajar con Bacillus cereus o con Alicyclobacillus, ambos formadores de esporas.
MALDI-TOF como método de confirmación
En microbiología de alimentos, el uso regulatorio más importante de MALDI-TOF es confirmar aislados presuntivos de patógenos. Para que un laboratorio pueda usarlo con ese fin, el método tiene que estar validado.
El método AOAC 2017.09
El método oficial AOAC 2017.09, basado en un sistema comercial de MALDI-TOF, cubre la confirmación e identificación de Salmonella spp., Cronobacter spp. y otros gramnegativos a partir de agares selectivos y no selectivos, y fue extendido luego a Campylobacter. El estudio colaborativo publicado en el Journal of AOAC International (2019) incluyó, para Salmonella, a 15 colaboradores de 15 laboratorios de servicio en Europa. Los autores informan un 100 % de identificaciones correctas a nivel de género para Salmonella y Cronobacter desde cada tipo de agar, y resultados equivalentes a los procedimientos de confirmación especificados en cada método de referencia.
El BAM de la FDA
El capítulo 5 del Manual Analítico Bacteriológico (BAM) de la FDA acepta la identificación por MALDI-TOF según AOAC OMA 2017.09 como una de las vías para confirmar aislados presuntivos de Salmonella, junto con la combinación de serología y bioquímica y otros métodos instrumentales validados. Lo desarrollamos en resultado presuntivo vs. confirmado.
ISO 16140-6 e ISO 16140-3
En el marco ISO, la validación de métodos alternativos de confirmación y tipificación está cubierta por ISO 16140-6:2019. Y como con cualquier método validado, cada laboratorio debe demostrar que lo aplica bien en sus propias condiciones. Para eso, en 2025 se publicó la enmienda 1 de ISO 16140-3, que agrega un protocolo específico para la verificación de métodos validados de identificación de microorganismos. La diferencia entre validar y verificar la explicamos en validación y verificación de métodos según ISO 16140.
Qué no puede hacer MALDI-TOF
- No detecta en la muestra. Necesita un aislado puro. No reemplaza al enriquecimiento ni al screening por PCR; entra después.
- Solo reconoce lo que está en la base de datos. Singhal y colaboradores recuerdan que un aislado nuevo solo puede identificarse si la base de datos contiene los perfiles de referencia correspondientes. Un microorganismo de deterioro poco frecuente puede quedar sin identificar.
- Tiene dificultades con especies muy cercanas. La misma revisión cita como ejemplos que no distingue de forma confiable Escherichia coli de Shigella, ni Streptococcus pneumoniae de S. mitis, sin pruebas adicionales.
- No reemplaza la tipificación de rutina. Identificar un aislado como Salmonella no dice a qué serovar pertenece. La serotipificación sigue siendo un paso aparte, y para la vinculación entre casos de un brote el estándar es la secuenciación genómica completa (WGS).
Dónde aporta más en una planta de alimentos
Además de la confirmación de patógenos, MALDI-TOF resulta útil en tareas donde se acumulan muchos aislados y la pregunta es "qué es esto":
- Deterioro: identificar la levadura o la bacteria aislada de un envase hinchado o de una bebida alterada orienta la búsqueda de causa raíz mucho más que un recuento total, como vimos en microorganismos de deterioro.
- Monitoreo ambiental: identificar los aislados recurrentes de un mismo punto de la planta permite ver si se repite la misma especie o si cada hallazgo es distinto.
- Colecciones de cepas internas: mantener un registro de las especies halladas en la planta ayuda a comparar hallazgos a lo largo del tiempo.
Singhal y colaboradores citan un estudio en el que la identificación por MALDI-TOF costó unos pocos dólares por muestra, frente a unos 100 dólares de la secuenciación del gen 16S rRNA, con resultados en minutos u horas en lugar de las 24 a 48 horas de los métodos convencionales. El costo del equipo es alto, por lo que la técnica suele concentrarse en laboratorios de alto volumen o de servicios, que la ofrecen a plantas que no tienen el equipo propio.
MALDI-TOF, PCR y WGS: tres preguntas distintas
Estas técnicas se complementan porque responden preguntas diferentes. La PCR responde si el material genético de un microorganismo está en la muestra o en el enriquecimiento. MALDI-TOF responde qué especie es una colonia ya aislada. La WGS responde si dos aislados son, en la práctica, la misma cepa. Un laboratorio bien organizado usa cada una en el punto del flujo en el que su respuesta es la que se necesita.
Conclusión
MALDI-TOF identifica un microorganismo a partir de la huella de sus proteínas ribosomales y reduce a minutos un paso que antes tomaba uno o dos días por aislado. En alimentos, su uso regulatorio más relevante es la confirmación de patógenos con métodos validados como AOAC 2017.09, aceptado por el BAM de la FDA, con ISO 16140-6 y la enmienda de 2025 de ISO 16140-3 como marco de validación y verificación. Sus límites también son claros: necesita una colonia pura, depende de la base de datos, tiene dificultades con especies muy cercanas y no reemplaza la tipificación.
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Preguntas frecuentes
¿MALDI-TOF puede analizar directamente un alimento?
No. Necesita una colonia pura crecida en placa. La técnica no identifica organismos a partir de poblaciones mezcladas, por lo que se usa después del cultivo, para identificar o confirmar aislados.
¿MALDI-TOF sirve para confirmar Salmonella?
Sí, con un método validado. El método AOAC 2017.09 cubre la confirmación de Salmonella spp. a partir de agares selectivos y no selectivos, y el BAM de la FDA lo acepta como una de las vías de confirmación de aislados presuntivos.
¿Por qué un aislado puede dar una puntuación baja?
Por una colonia mezclada, poca biomasa, una preparación insuficiente para ese tipo de microorganismo, un cultivo demasiado viejo (con esporas, por ejemplo) o porque la especie no está en la base de datos. El procedimiento debe indicar si se repite con extracción, se subcultiva o se usa otro método.
¿MALDI-TOF reemplaza la serotipificación o la WGS?
No. Identifica la especie o el género, pero no el serovar de Salmonella ni la relación genética entre aislados. Para eso se usan la serotipificación y la secuenciación genómica completa.