Parte del pilar de fundamentos y estandarización del Centro de Aprendizaje TAAG. Complementa la guía sobre la certificación AOAC-PTM y la de cultivo microbiológico tradicional.
Índice del artículo
Dos preguntas distintas sobre un mismo método
Antes de usar un método microbiológico en rutina, un laboratorio tiene que responder dos preguntas. La primera es si el método funciona: si detecta o cuantifica el microorganismo objetivo con un desempeño aceptable frente a una referencia reconocida. La segunda es si funciona en sus manos, con su personal, sus equipos y los alimentos que analiza todos los días. La primera pregunta la responde la validación; la segunda, la verificación.
La distinción no es un tecnicismo. La norma ISO/IEC 17025:2017, que rige la competencia de los laboratorios de ensayo, exige que el laboratorio verifique que puede aplicar correctamente un método antes de introducirlo, demostrando que alcanza el desempeño requerido y conservando los registros. Un método validado que nadie verificó en el laboratorio que lo usa deja un hueco que suele aparecer en las auditorías. Los requisitos de acreditación se desarrollan en el artículo sobre ISO/IEC 17025 en laboratorios de alimentos.
Validación: establecer el desempeño del método
La validación consiste en determinar las características de desempeño de un método y aportar evidencia objetiva de que cumple los requisitos para un uso previsto. En microbiología de alimentos eso significa, casi siempre, comparar un método alternativo (por ejemplo, un kit de PCR o un medio cromogénico) con un método de referencia, que suele ser un protocolo de cultivo tradicional normalizado como ISO 6579-1 para Salmonella.
La serie ISO 16140
El comité técnico ISO/TC 34/SC 9 reemplazó la antigua ISO 16140:2003 por una serie de normas, cada una pensada para un escenario distinto:
- ISO 16140-1:2016: vocabulario común de validación.
- ISO 16140-2:2016: protocolo para validar métodos alternativos, en su mayoría comerciales, frente a un método de referencia. Tiene una enmienda publicada en 2024 que revisó parte de los cálculos.
- ISO 16140-3:2021: protocolo para verificar, en un único laboratorio, métodos de referencia y métodos alternativos ya validados.
- ISO 16140-4: validación en un solo laboratorio. Sus resultados solo son válidos para el laboratorio que hizo el estudio.
- ISO 16140-5: validación interlaboratorio factorial para métodos no comerciales, con menos laboratorios participantes que en la parte 2.
- ISO 16140-6:2019: validación de métodos alternativos de confirmación y tipificación, que parten de una colonia sospechosa y no de una muestra de alimento.
La serie se completa con ISO 17468, que fija los requisitos técnicos para establecer o revisar un método de referencia normalizado.
Qué incluye una validación según ISO 16140-2
El protocolo tiene dos fases. La primera es un estudio comparativo que se realiza en un laboratorio organizador: se analizan muestras contaminadas con ambos métodos para medir la sensibilidad, se determina el nivel de detección relativo (RLOD) y se comprueba la inclusividad y exclusividad con 50 cepas del microorganismo objetivo y 30 cepas no objetivo. En los métodos cuantitativos, el estudio comparativo evalúa la veracidad relativa y el perfil de exactitud. La segunda fase es un estudio interlaboratorio, en el que varios laboratorios analizan las mismas muestras para estimar la reproducibilidad del método.
El alcance de la validación depende de las categorías de alimentos estudiadas. Para declarar un método válido para una "amplia gama de alimentos" deben cubrirse al menos cinco categorías. Esa declaración de alcance es lo primero que conviene revisar en un certificado.
Quién certifica
En Europa, organismos independientes como MicroVal, NF Validation (AFNOR) y NordVal (NMKL) emiten certificados basados en ISO 16140-2 y publican los informes en sus sitios. En Estados Unidos el esquema más difundido es el de AOAC International, que explicamos en la guía sobre la certificación AOAC-PTM.
Qué dice la regulación europea
El Reglamento (CE) 2073/2005 establece en su artículo 5 que los métodos analíticos del anexo I son los de referencia, y que usar métodos alternativos es aceptable cuando están validados frente a esa referencia y, si son comerciales, certificados por un tercero según el protocolo de EN ISO 16140 u otros protocolos similares aceptados internacionalmente. El Reglamento (UE) 2019/229 añadió definiciones clave: qué se entiende por "amplia gama de alimentos" y qué es un organismo de certificación independiente del fabricante del método.
Verificación: demostrar que el método funciona en tu laboratorio
ISO 16140-3 define la verificación como la demostración de que un método validado funciona en manos del usuario según las especificaciones de su validación. Divide el proceso en dos etapas.
Etapa 1: verificación de la implementación
El laboratorio demuestra que sabe ejecutar el método usando un solo alimento, elegido entre los que se analizaron en el estudio de validación. Si los resultados se parecen a los de la validación, el problema de fondo (la técnica) está resuelto.
Etapa 2: verificación de los alimentos del laboratorio
Luego el laboratorio demuestra que el método funciona con los alimentos que declara analizar. Para eso elige un alimento "difícil" de cada categoría incluida en su alcance: productos con baja actividad de agua, con antimicrobianos naturales como las especias, con lecitina, con mucha grasa. La guía de formación del propio comité ISO muestra ejemplos como helado, huevo en polvo, carne condimentada y cacao en polvo.
Qué se mide y con qué criterio de aceptación
Métodos cualitativos: eLOD50
En los métodos de detección se estima el nivel de detección al 50 % (eLOD50): la contaminación a la que el método da positivo en la mitad de las porciones analizadas. Se llama "estimado" porque la cantidad de muestras es mucho menor que en una validación completa. El criterio de aceptación es que el eLOD50 obtenido no supere cuatro veces el LOD50 de la validación. En el ejemplo de la guía de formación de ISO para Salmonella según ISO 6579-1, el LOD50 de referencia era de 5,7 UFC, el límite quedaba en 22,8 UFC y el laboratorio obtuvo 3,0 UFC, con lo que cumplía. El concepto de LOD50 se desarrolla en el artículo sobre límite de detección e incertidumbre de medición.
Métodos cuantitativos: reproducibilidad y sesgo
En los recuentos, la verificación de la implementación mide la desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio (SIR), con un diseño alineado con ISO 19036. El criterio es que no supere el doble del menor valor medio de reproducibilidad obtenido en la validación. La verificación de los alimentos mide el sesgo estimado (eBias): se contaminan porciones en tres niveles, por duplicado, y la diferencia frente al nivel esperado no debe superar 0,5 log10 en ningún nivel.
Métodos de confirmación y tipificación
Aquí solo se exige la verificación de la implementación: se prueban cepas objetivo y no objetivo (en el ejemplo de la guía, cinco de cada tipo) y se exige un 100 % de concordancia con el resultado esperado.
El plazo de 2028 para los métodos de referencia no validados
Muchas normas ISO de referencia se publicaron sin datos de desempeño. Para ellas, ISO 16140-3 ofrece un protocolo transitorio en su anexo F. Según el documento de transición del comité ISO, ese anexo puede usarse hasta el 31 de diciembre de 2027; desde el 1 de enero de 2028, solo los métodos de referencia validados podrán verificarse conforme a ISO 16140-3. Las normas ISO son voluntarias, pero los organismos de acreditación suelen tomarlas como criterio.
El mismo documento aclara cuándo hay que volver a verificar. Un método ya acreditado no necesita una nueva verificación salvo que cambie. Un método nuevo o una categoría de alimentos nueva dentro del alcance sí la necesitan. Si un método validado sufre un cambio técnico mayor con impacto relevante, también.
Si la verificación no cumple
La norma pide un análisis de causa raíz antes de repetir. Las causas habituales son la preparación y el nivel del inóculo, la homogeneización de la muestra, la calibración de equipos, lotes de medios o reactivos y la aplicación del protocolo por el analista. Si el problema persiste, el siguiente paso es consultar al proveedor del método (si es comercial), al organismo de normalización (si es de referencia) o al organismo de certificación.
Errores comunes
- Dar por hecho que un certificado de validación reemplaza la verificación en el laboratorio.
- Aplicar el método a alimentos de una categoría que no está en el alcance de su validación.
- Verificar solo con un alimento "fácil" y no con uno representativo de las dificultades reales del laboratorio.
- No conservar los registros de verificación, que son exigibles bajo ISO/IEC 17025.
- Cambiar una etapa del protocolo, como el tiempo de enriquecimiento, y seguir tratando el método como validado.
Conclusión
Validar y verificar responden preguntas diferentes: si un método funciona y si funciona en tu laboratorio. La serie ISO 16140 ordena ambos procesos, desde la validación de métodos alternativos según ISO 16140-2 hasta la verificación en un único laboratorio según ISO 16140-3, con criterios de aceptación concretos como el eLOD50 o el eBias. Revisar el alcance del certificado, verificar con alimentos representativos y conservar los registros evita que un método bien validado se convierta en un punto débil del laboratorio.
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Conoce cómo TAAG documenta el alcance validado de sus kits de detección molecular para facilitar su verificación en el laboratorio de cada cliente.
Preguntas frecuentes
¿Qué diferencia hay entre validar y verificar un método microbiológico?
La validación establece el desempeño del método y demuestra que sirve para un uso previsto, normalmente comparándolo con un método de referencia. La verificación demuestra que un laboratorio concreto obtiene ese desempeño al aplicarlo con sus propios equipos, personal y alimentos.
¿Un método con certificado MicroVal, NF Validation o AOAC necesita verificarse?
Sí. El certificado respalda al método, pero ISO/IEC 17025 exige que cada laboratorio verifique que puede aplicarlo correctamente antes de usarlo, y ISO 16140-3 describe cómo hacerlo.
¿Qué es el eLOD50?
Es el nivel de detección al 50 % estimado durante la verificación de un método cualitativo: la contaminación a la que el método detecta el microorganismo en la mitad de las porciones analizadas. ISO 16140-3 acepta el resultado si no supera cuatro veces el LOD50 obtenido en la validación.
¿Qué pasa con los métodos de referencia ISO que no tienen datos de validación?
Hasta el 31 de diciembre de 2027 pueden verificarse con el protocolo transitorio del anexo F de ISO 16140-3. A partir del 1 de enero de 2028, solo los métodos de referencia validados podrán verificarse según esa norma.