Parte del pilar de fundamentos y estandarización del Centro de Aprendizaje TAAG. Profundiza en lo que vimos sobre cómo se interpretan las UFC y en la etapa de enriquecimiento microbiológico.
Índice del artículo
Un resultado microbiológico siempre trae un margen
Un informe dice "Salmonella: no detectada en 25 g" o "aerobios mesófilos: 1,2 × 105 UFC/g". Los dos resultados parecen definitivos, pero ninguno lo es del todo. El primero depende de la probabilidad de que el método detecte las pocas células que pudiera haber en la porción analizada. El segundo es una estimación con una dispersión que, en microbiología, es mucho mayor que en un análisis químico. Entender esos márgenes es lo que permite decidir bien cuando un resultado queda cerca de un límite.
Por qué la microbiología es distinta
Las bacterias no se reparten en un alimento como una sustancia disuelta. Son partículas discretas, a menudo agrupadas, y cuando están en baja concentración su presencia en una porción de ensayo es cuestión de azar. Si un lote tiene en promedio una célula de Salmonella por cada 25 g, algunas porciones de 25 g no tendrán ninguna, otras tendrán una y otras dos o más. Ese reparto aleatorio sigue una distribución de Poisson, y fija un límite teórico que ningún método puede superar.
El techo teórico de cualquier método
Con una distribución de Poisson, la probabilidad de que una porción contenga al menos una célula es 1 − e−λ, donde λ es el número medio de células por porción. Con un promedio de 1 UFC por porción, esa probabilidad es de alrededor del 63 %: aun un método perfecto fallaría en más de un tercio de los casos, simplemente porque la célula no está en la porción. Para alcanzar un 50 % de detección basta un promedio de ln 2, unas 0,69 UFC por porción; para llegar al 95 % se necesitan unas 3 UFC por porción.
Métodos cualitativos: del LOD al LOD50
En un método de detección (presencia o ausencia), el límite de detección no se expresa como un número fijo, sino como una curva de probabilidad de detección (POD) en función de la contaminación. Wilrich y Wilrich describieron en 2009, en el Journal of AOAC International, un modelo estadístico para estimar esa curva y el LODp, la contaminación que el método detecta con una probabilidad p. El valor más usado es el LOD50: la concentración a la que el método da positivo en la mitad de las porciones analizadas.
El LOD50 permite comparar métodos entre sí y con el techo teórico. ISO 16140-2 lo usa para calcular el nivel de detección relativo (RLOD) entre un método alternativo y el de referencia, e ISO 16140-3 pide a cada laboratorio estimar su propio eLOD50 al verificar un método y comprobar que no supera cuatro veces el de la validación. El procedimiento se explica en el artículo sobre validación y verificación de métodos.
Qué significa "ausencia en 25 g"
Un resultado negativo significa que el método no detectó el microorganismo en esa porción, no que el lote esté libre de él. Por eso los criterios de ausencia se aplican sobre varias unidades de muestra, y por eso importa tanto la etapa de enriquecimiento: es la que permite que una sola célula, muchas veces dañada, se multiplique hasta niveles detectables. Cuántas unidades analizar y qué probabilidad de detectar un lote contaminado ofrece cada plan se desarrolla en el artículo sobre planes de muestreo por atributos.
Métodos cuantitativos: el límite de cuantificación
En un recuento en placa, el límite inferior lo fija la menor dilución sembrada. Si se siembra 1 mL de la dilución 10−1 y no crece ninguna colonia, el resultado no es "0 UFC/g", sino "menor que 10 UFC/g" (en el ejemplo de la guía de ISO 19036, con dos diluciones sin colonias, el límite calculado es de 9,1 UFC/g). Reportar "0" es uno de los errores de interpretación que ya comentamos en el artículo sobre UFC.
Incertidumbre de medición en recuentos: ISO 19036:2019
ISO/IEC 17025 exige a los laboratorios acreditados evaluar la incertidumbre de medición de sus ensayos. Para los recuentos de microbiología de alimentos, la referencia es ISO 19036:2019, publicada en octubre de 2019 como revisión de la especificación técnica de 2006. La presentación del grupo de trabajo de ISO recuerda que los resultados cuantitativos en microbiología son muy variables, del orden de 0,1 a 1 log10.
Los tres componentes
- Incertidumbre técnica: la variabilidad de las etapas del análisis (pesada, diluciones, siembra, incubación, recuento, confirmación, lotes de medios, analistas). Se estima preferentemente como la desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio (sIR), analizando al menos 10 muestras con dos resultados cada una bajo condiciones que varíen tanto como en la rutina. Suele ser el componente mayor.
- Incertidumbre de matriz: en qué medida la porción de ensayo no representa a la muestra de laboratorio. Para líquidos o muestras bien homogeneizadas puede usarse un valor fijo de 0,1 log10; en alimentos sólidos o de varios componentes puede ser mucho mayor.
- Incertidumbre distribucional: la variación aleatoria de Poisson. Se calcula a partir del total de colonias contadas (0,4343/√ΣC en log10) y pesa sobre todo cuando se cuentan pocas colonias.
Incertidumbre expandida y cómo se informa
Los componentes se combinan como raíz cuadrada de la suma de sus cuadrados, y el resultado se multiplica por un factor de cobertura k = 2, lo que corresponde aproximadamente a un nivel de confianza del 95 %. La norma también admite una opción simplificada, usar solo la reproducibilidad, advirtiendo que puede subestimar la incertidumbre en alimentos sólidos o a niveles bajos.
El ejemplo de la guía de ISO lo muestra bien: un recuento de 1,00 × 105 UFC/g, con una incertidumbre expandida de 0,31 log10, se informa como 5,00 ± 0,31 log10 UFC/g. En valores naturales, el intervalo va de 4,90 × 104 a 2,04 × 105 UFC/g: más del doble entre un extremo y otro.
Lo que la incertidumbre de medición no incluye
ISO 19036 deja fuera dos fuentes de error. La primera es la incertidumbre de muestreo, el error de extraer la muestra de laboratorio del lote, que puede ser grande pero no se atribuye al laboratorio. La segunda es el sesgo: en microbiología de alimentos no existe un valor "verdadero" independiente del método con el que comparar un resultado de rutina.
Del número a la decisión
Imagina un recuento de 1,2 × 102 UFC/g frente a un límite de 100 UFC/g. Con una incertidumbre expandida típica de varias décimas de log, el valor real podría estar por debajo del límite. ¿El producto cumple o no? La respuesta depende de la regla de decisión. ISO/IEC 17025 pide que, cuando el laboratorio declara conformidad, documente la regla que usa y el riesgo de aceptar o rechazar por error. Un criterio habitual considera no conforme un resultado solo si supera el límite en más de la incertidumbre expandida; otro, más conservador, considera conforme solo lo que queda por debajo del límite menos esa incertidumbre. Elegir entre ellos es una decisión de gestión del riesgo, no un detalle del laboratorio.
Errores comunes
- Leer "no detectado" como garantía de ausencia en todo el lote.
- Comparar métodos solo por su tiempo de respuesta, sin revisar su LOD50 en la matriz de interés.
- Informar "0 UFC/g" en lugar de "< límite de cuantificación".
- Tratar diferencias de 0,2 o 0,3 log entre dos recuentos como un cambio real del proceso.
- Pedir la declaración de conformidad sin acordar antes la regla de decisión.
Conclusión
En microbiología, un resultado nunca llega solo: trae una probabilidad de detección si es cualitativo y una incertidumbre si es cuantitativo. El LOD50 permite comparar métodos y entender qué significa realmente un negativo; ISO 19036 permite ponerle un intervalo a cada recuento. Usar esos márgenes, junto con una regla de decisión acordada, es lo que evita liberar o rechazar un lote por una diferencia que el propio método no puede distinguir.
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Preguntas frecuentes
¿Qué es el LOD50 de un método microbiológico?
Es la concentración del microorganismo a la que un método de detección da positivo en el 50 % de las porciones analizadas. Se usa porque en microbiología la detección es probabilística: incluso un método perfecto solo alcanza el 50 % de detección con unas 0,69 UFC promedio por porción, por la distribución aleatoria de las células.
¿Por qué un resultado "no detectado" no significa cero?
Porque el método solo analiza una porción de la muestra y tiene un límite de detección. Si el microorganismo está en baja concentración o distribuido de forma irregular, puede no estar en la porción analizada o no alcanzar niveles detectables.
¿Qué norma se usa para estimar la incertidumbre de un recuento microbiológico?
ISO 19036:2019. Combina la incertidumbre técnica, la de matriz y la distribucional, y expresa el resultado como incertidumbre expandida con un factor de cobertura k = 2, aproximadamente un 95 % de confianza.
¿La incertidumbre de medición incluye el error de muestreo del lote?
No. ISO 19036 excluye expresamente la incertidumbre de muestreo, es decir, el error de extraer la muestra del lote. Ese riesgo se gestiona con el diseño del plan de muestreo.