Parte del pilar de métodos de laboratorio del Centro de Aprendizaje TAAG, junto con enriquecimiento microbiológico.
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Un positivo no siempre es un resultado final
En un informe de laboratorio, "positivo" puede significar dos cosas distintas. Puede ser un resultado presuntivo: la prueba dio una señal compatible con el microorganismo buscado, pero todavía no se demostró su identidad. O puede ser un resultado confirmado: se aisló el microorganismo y se comprobó, con pruebas adicionales, que es realmente el objetivo del análisis. Confundir ambos lleva a decisiones apresuradas en un sentido o en otro: liberar producto que debía retenerse o destruir un lote por un resultado que no se sostenía.
Este artículo recorre ese tramo del análisis, desde el screening hasta la confirmación, tomando como referencia el Manual Analítico Bacteriológico (BAM) de la FDA para Salmonella y la serie de normas ISO 16140, que define cómo se validan los métodos alternativos frente a los de referencia.
De dónde sale un resultado presuntivo
En el cultivo tradicional
En el cultivo microbiológico tradicional, una colonia con la morfología típica en un medio selectivo es un hallazgo presuntivo. El capítulo 5 del BAM describe la secuencia para Salmonella: preparación y pre-enriquecimiento el primer día, enriquecimiento selectivo el segundo, siembra en placas selectivas el tercero, screening bioquímico el cuarto y confirmación el quinto. El propio manual indica que el método de cultivo toma de 4 a 5 días para llegar a un resultado presuntivo.
En los métodos moleculares de screening
La PCR y otros métodos rápidos suelen usarse como screening. La edición del BAM de enero de 2026 incluye una sección, agregada en mayo de 2024, con métodos de qPCR y LAMP desarrollados por la FDA que se aplican al cultivo de pre-enriquecimiento de 24 horas, es decir, el segundo día. La regla que fija el manual es clara: las muestras con screening negativo se informan como negativas y no requieren más análisis de cultivo; las muestras con screening positivo deben confirmarse por cultivo siguiendo los procedimientos de aislamiento e identificación.
Esa asimetría explica el valor del screening. La mayoría de las muestras de rutina son negativas, y para ellas el resultado llega días antes. Solo las positivas recorren el camino largo.
Qué dice ISO 16140-2 sobre la confirmación
ISO 16140-2:2016 es el protocolo de validación de métodos alternativos (en general comerciales) frente a un método de referencia. La norma parte de una idea útil para el trabajo diario: muchos métodos alternativos tienen dos pasos, primero el enriquecimiento y la detección, y después la confirmación de ese resultado. El resultado final del método es el que sale del segundo paso.
Durante la validación, la norma exige confirmar los positivos del método alternativo que no coinciden con el método de referencia, porque esa confirmación es la que permite saber si se trata de un verdadero o de un falso positivo. La confirmación debe ser capaz de recuperar el aislado y demostrar su identidad, y puede basarse en el procedimiento del método de referencia, en el paso de confirmación del propio método alternativo, en una combinación de ambos o en cualquier otro medio que logre aislar e identificar al microorganismo.
Hay un detalle técnico con consecuencias prácticas. Si el enriquecimiento del método alternativo es distinto al de referencia (menos etapas o menos horas de incubación), la norma pide una segunda vía de confirmación: derivar parte del enriquecimiento del método alternativo al esquema del método de referencia, respetando al menos su tiempo total de incubación. En otras palabras, un enriquecimiento corto puede alcanzar para detectar una señal molecular, pero no necesariamente para recuperar una colonia en placa.
Esta norma tiene peso regulatorio. En la Unión Europea, el Reglamento (UE) 2019/229 modificó el artículo 5 del Reglamento (CE) 2073/2005 para exigir que los métodos alternativos estén validados frente al método de referencia del anexo I conforme a EN ISO 16140-2, y que los métodos registrados estén certificados por un organismo independiente. En la práctica, la validación y la certificación AOAC-PTM o ISO 16140 de un método incluyen su protocolo de confirmación.
Cómo se confirma hoy
Bioquímica y serología
La vía clásica combina pruebas bioquímicas, que evalúan qué sustratos metaboliza el aislado, con serología, que identifica antígenos de superficie. Para Salmonella, el BAM pide que la confirmación serológica, con los antígenos somáticos (O) y flagelares (H), vaya siempre acompañada de confirmación bioquímica. Permite reemplazar la batería de tubos convencional por sistemas como API 20E, Enterotube II o Vitek 2 GN, pero advierte que los kits bioquímicos comerciales no sustituyen a la serología.
Métodos instrumentales y moleculares sobre el aislado
El BAM también acepta como confirmación de aislados presuntivos una qPCR y un LAMP desarrollados por la FDA, un método de amplificación isotérmica (AOAC OMA 2013.14) y la identificación por espectrometría de masas MALDI-TOF (AOAC OMA 2017.09), además de otros métodos validados según las guías de la FDA, el Apéndice J de AOAC o ISO 16140-6:2019. Un aislado se informa como Salmonella si lo confirman la serología y la bioquímica juntas, o uno de los métodos instrumentales aceptados. Si las confirmaciones se contradicen, se recurre a pruebas adicionales o a un laboratorio de referencia para la tipificación definitiva.
ISO 16140-6: validar el propio método de confirmación
ISO 16140-6:2019 cubre la validación de métodos alternativos de confirmación y de tipificación. Compara el método alternativo con el procedimiento de confirmación del método de referencia o, cuando hace falta, con un método de confirmación de referencia como la secuenciación genómica completa (WGS). También aplica a la tipificación, por ejemplo la serotipificación de Salmonella o la tipificación molecular de STEC.
Por qué un presuntivo puede no confirmarse
Un positivo de screening que no se confirma no significa automáticamente que la prueba "se equivocó". Las causas posibles son varias y conviene distinguirlas:
- Material genético sin célula viable: un método basado en ADN puede detectar restos de células inactivadas por un tratamiento térmico o un sanitizante, un límite que explicamos en RNA vs. ADN. En ese caso no hay nada vivo que aislar.
- Reactividad cruzada: un organismo no objetivo que comparte parte de la secuencia buscada. Es lo que evalúa el estudio de exclusividad durante la validación del método.
- Dificultad para recuperar el aislado: células estresadas, una microbiota acompañante que compite en el enriquecimiento o niveles muy bajos pueden impedir obtener la colonia aunque el patógeno estuviera presente. Por eso ISO 16140-2 contempla la segunda vía de confirmación cuando los enriquecimientos difieren.
- Contaminación en el laboratorio: un arrastre de material amplificado o de un control positivo. Los controles de cada corrida, que desarrollamos en controles de una PCR, existen para detectarlo.
Qué hacer mientras llega la confirmación
La confirmación es un paso analítico, pero la decisión sobre el producto la toma la planta. Algunos criterios razonables:
- Producto terminado: un lote con resultado presuntivo positivo se retiene hasta la confirmación. Liberar un lote "porque todavía no está confirmado" invierte la lógica del screening.
- Ambiente: en un programa de monitoreo ambiental, muchas plantas tratan el presuntivo como una señal para actuar de inmediato (limpieza reforzada, muestreo de vectores alrededor del punto positivo) sin esperar la confirmación, porque el costo de reaccionar tarde es mayor.
- Trazabilidad del aislado: si el resultado se confirma, conservar el aislado permite tipificarlo después y compararlo con hallazgos anteriores de la misma planta.
Lo que no conviene es informar como definitivo un presuntivo, ni descartar un presuntivo no confirmado sin entender por qué no se confirmó. Ambas cosas son decisiones de laboratorio que deben estar escritas en el procedimiento antes de que llegue el primer positivo.
Conclusión
Un resultado presuntivo es una señal que todavía no demostró la identidad del microorganismo, y un confirmado es un aislado identificado con pruebas adicionales. El BAM de la FDA exige confirmar por cultivo los positivos de screening, ISO 16140-2 integra la confirmación en la validación de los métodos alternativos e ISO 16140-6 permite validar métodos más rápidos para ese paso. Entre ambos momentos, la planta decide: retener el producto, actuar sobre el ambiente y dejar escrito qué se hace cuando un presuntivo no se confirma.
Sobre TAAG
Conversa con TAAG sobre cómo integrar screening molecular y confirmación en el procedimiento de tu laboratorio según el marco regulatorio que aplica a tus productos.
Preguntas frecuentes
¿Un positivo por PCR es un resultado definitivo?
En la mayoría de los esquemas, no. El BAM de la FDA establece que las muestras con screening positivo por qPCR o LAMP deben confirmarse por cultivo, mientras que las negativas se informan como negativas sin más análisis.
¿Cuánto tarda la confirmación de Salmonella por cultivo?
El BAM describe un flujo de cinco días: pre-enriquecimiento, enriquecimiento selectivo, siembra en placas, screening bioquímico y confirmación. El propio manual indica que el método de cultivo toma de 4 a 5 días para llegar a un resultado presuntivo.
¿Se puede confirmar con MALDI-TOF o PCR en lugar de serología?
Sí, sobre el aislado. El BAM acepta, entre otros, una qPCR y un LAMP de la FDA y la identificación por MALDI-TOF (AOAC OMA 2017.09). ISO 16140-6:2019 define cómo validar estos métodos alternativos de confirmación.
¿Qué significa que un presuntivo no se confirme?
Puede tratarse de un falso positivo, pero también de ADN de células no viables, de un aislado difícil de recuperar o de una contaminación en el laboratorio. Por eso conviene investigar la causa antes de descartar el resultado.