Este artículo sigue a la muestra después de transporte y conservación de muestras y completa los planes de muestreo por atributos con lo que pasa dentro del laboratorio.
Índice del artículo
El paso que nadie ve en el informe
Un resultado microbiológico se informa como "ausencia en 25 g" o "3.200 UFC/g", pero entre la bolsa que llega al laboratorio y la placa o el caldo hay una etapa que casi nunca aparece en el informe: la preparación de la muestra. Cuánto se pesa, en qué diluyente, cuánto se homogeneiza, cuánto espera la suspensión y si se juntan porciones: cada decisión cambia lo que el número significa. La toma de muestras en planta está en muestreo de superficies y el traslado hasta el laboratorio en transporte y conservación de muestras; este artículo empieza donde esos terminan, con la muestra ya recibida.
La referencia internacional para esta etapa es la serie ISO 6887, del comité ISO/TC 34/SC 9. Tiene seis partes: la 6887-1:2017 fija las reglas generales y las otras cinco bajan a grupos de productos: carnes (6887-2:2017), pescados y productos de la pesca (6887-3:2017), productos varios como huevos, vegetales, cacao, hierbas y especias (6887-4:2017), leche y productos lácteos (6887-5:2020) y muestras de producción primaria, de la granja al matadero (6887-6:2013). Si el método específico de un microorganismo trae instrucciones propias, estas tienen prioridad.
La suspensión inicial 1:10, paso a paso
Pesada y proporción
ISO 6887-1 pide pesar o medir la porción analítica con una tolerancia de ±5 %, con un mínimo de 10 g o 10 mL salvo que el método indique otra cosa, y agregar 9 veces esa cantidad de diluyente, medido preferentemente por masa con una tolerancia de ±2 %. Así se obtiene la dilución 1:10. La norma admite otras proporciones cuando hacen falta: 1 en 20, 1 en 50 o 1 en 100 para productos que dan suspensiones demasiado espesas, y 1 en 2 o 1 en 5 cuando se buscan recuentos bajos, aunque advierte que estas últimas pueden desbalancear la relación entre inóculo y medio y deben verificarse caso a caso. Cualquier proporción no estándar se arrastra al cálculo final.
Diluyentes
Para uso general la norma define dos diluyentes: la solución salina peptonada (1 g de digerido enzimático de caseína y 8,5 g de cloruro de sodio por litro) y el agua peptonada tamponada, ambos con pH final de 7,0 ± 0,2 a 25 °C. Existe además una versión de doble concentración del agua peptonada tamponada para productos muy ácidos. El volumen final no puede desviarse más de ±2 % y los diluyentes deben superar una prueba de desempeño: tras 45 minutos a 1 hora a temperatura ambiente, el recuento de la cepa de control debe quedar dentro de ±30 % del inicial. Los requisitos de desempeño de diluyentes y medios se detallan en ISO 11133.
Homogeneización
La mezcla se homogeneiza según ISO 7218 (cuarta edición, de 2024), con un homogeneizador rotatorio (licuadora de laboratorio) o uno peristáltico, el equipo de paletas que golpea una bolsa estéril y que en los laboratorios suele llamarse stomacher. Si hace falta, las partículas grandes se dejan sedimentar hasta 15 minutos; las bolsas con filtro integrado son una alternativa equivalente. Para productos duros o secos, la norma limita el homogeneizador rotatorio a 2,5 minutos seguidos y el picado o la molienda previa a 1 minuto, para evitar que la muestra se caliente. El manual del FDA para alimentos (BAM, capítulo 1) usa para los recuentos 50 g de muestra en 450 mL de diluyente fosfato de Butterfield, licuados durante 2 minutos.
Tiempos máximos
ISO 6887-1 establece que entre el final de la preparación de la suspensión inicial y el contacto del inóculo con el medio de cultivo final no pueden pasar más de 45 minutos, y que entre la suspensión inicial y el comienzo de las diluciones no pueden pasar más de 30 minutos. Si el laboratorio está por encima de 27 °C, ambos tiempos deberían acortarse. El BAM es más estricto: no más de 15 minutos desde la homogeneización hasta que todas las diluciones estén en sus medios. En una suspensión rica en nutrientes los microorganismos pueden empezar a multiplicarse y el resultado sale más alto que la muestra real.
Diluciones decimales
Para cada paso decimal se transfiere 1 mL ± 0,02 mL a un tubo con 9 mL ± 0,2 mL de diluyente, sin introducir la pipeta más de 1 cm, mezclando de 5 a 10 segundos y con una punta nueva en cada paso.
Reglas por tipo de alimento
Congelados
Para envases pequeños (en general menos de 2 kg), ISO 6887-1 permite llevarlos a una consistencia que deje tomar la porción, a 18-27 °C por un máximo de 3 horas o a 5 ± 3 °C por un máximo de 24 horas, y desaconseja descongelar en baño de agua o bajo el chorro, por el riesgo de contaminación si el envase no es hermético. El BAM prefiere no descongelar y, si hace falta, lo hace a 2-5 °C en un máximo de 18 horas, o por debajo de 45 °C durante no más de 15 minutos con agitación en baño termostatizado.
Carnes
ISO 6887-2 cubre carnes frescas, refrigeradas, congeladas, curadas, fermentadas, picadas, preparados cárnicos, carne separada mecánicamente, carnes cocidas, secas y ahumadas, extractos concentrados y muestras de canal tomadas por escisión o hisopado. Distingue, entre otros casos, bloques y cortes, embutidos con piel y muestras de superficie o de profundidad. La toma de muestras en la canal es materia de ISO 17604. El contexto de la industria está en microbiología en la industria cárnica.
Lácteos
ISO 6887-5 tiene procedimientos propios para leche líquida, leche y suero en polvo, quesos, caseínas y caseinatos (con un caso especial para la caseína al cuajo), manteca, helados, postres lácteos de pH superior a 5, leches fermentadas y yogures de pH inferior a 5 y fórmulas infantiles en polvo. El BAM ilustra por qué no se puede tratar todo igual: para Salmonella en queso licúa 25 g con 225 mL de caldo lactosado durante 2 minutos, deja reposar 60 minutos y ajusta el pH a 6,8 ± 0,2; la leche en polvo descremada instantánea, en cambio, se vierte suavemente sobre la superficie del caldo y se incuba sin mezclar.
Pescados y mariscos
ISO 6887-3 abarca pescado entero o en filetes, crustáceos, cefalópodos, moluscos bivalvos, gasterópodos, tunicados y equinodermos, además de ahumados, cocidos y bloques congelados, e incluye procedimientos especiales para moluscos, tunicados y equinodermos crudos de zonas de producción primaria.
Alimentos secos, ácidos y grasos
- Baja humedad: pesar primero el diluyente y luego agregar la porción, para reducir el choque osmótico, y dejar remojar hasta 1 hora si el producto es duro. El BAM, para polvos, agrega primero unos 15 mL de caldo, forma una suspensión sin grumos y completa el volumen en porciones.
- Ácidos: la suspensión debe volver a pH 7,0 ± 0,5. El agua peptonada tamponada basta para productos de pH 4,5 o más; entre pH 3,5 y 4,5 puede usarse la de doble concentración, verificando el pH la primera vez.
- Grasos (más de 20 %): puede añadirse polisorbato 80 al diluyente, entre 1 y 10 g/L; en general alcanza con 1 g/L por cada 10 % de grasa.
- Especias inhibitorias: el BAM agrega sulfito de potasio al 0,5 % para cebolla y ajo deshidratados, y diluye pimienta de Jamaica, canela y orégano a 1:100 y el clavo de olor a 1:1000, porque no se conoce una forma de neutralizar su efecto.
Compuestas y agrupadas: no es lo mismo
Juntar unidades de un mismo lote ahorra trabajo y reactivos. La enmienda 1 de 2024 a ISO 6887-1 precisa dos conceptos que en la práctica se confunden:
- Muestra compuesta: se mezclan varias unidades y de la mezcla se toma una porción del tamaño que indica el método, por ejemplo 25 g. El resultado sigue expresándose en 25 g.
- Muestra agrupada (pooling): se juntan varias unidades o porciones y se analiza la mezcla completa. El resultado se expresa en la masa total, por ejemplo 100 g o 375 g.
Puede agruparse fuera del laboratorio, uniendo muestras individuales en una mayor, o dentro de él, uniendo porciones en un único preenriquecimiento grande o uniendo caldos ya preenriquecidos. Hay reglas firmes: solo para ensayos cualitativos, solo con unidades del mismo origen (mismo lote o partida) y sin combinar dos modalidades a la vez, por ejemplo agrupar porciones y luego agrupar también sus caldos.
25 g o 375 g: qué cambia al agrandar la porción
El esquema clásico viene del BAM: de cada unidad de muestra se toma una porción de 25 g y hasta 15 porciones pueden reunirse en una compuesta de 375 g, que se analiza completa manteniendo la proporción 1:9 (375 g en 3.375 mL de caldo). El número de unidades depende de la categoría del alimento: 60 para la categoría I (sin paso letal y destinado a adultos mayores, enfermos o lactantes), 30 para la II y 15 para la III, es decir, 4, 2 o 1 compuesta de 375 g. Un solo positivo rechaza el lote. El BAM excluye de la composición, entre otros, la leche en polvo no instantánea y la leche entera en polvo.
La enmienda de 2024 pone condiciones técnicas para que el volumen grande no esconda un positivo:
- El caldo de preenriquecimiento debe estar precalentado a la temperatura de incubación.
- Hay que conocer el perfil de temperatura del volumen grande. Tomando el ejemplo de ISO 6579-1, cuyo preenriquecimiento dura entre 16 y 20 horas, la mezcla debe mantenerse entre 34 °C y 38 °C durante al menos 16 horas, y el tiempo hasta llegar a esa temperatura debe minimizarse.
- La proporción muestra/diluyente del método validado no se cambia, salvo para aumentarla en matrices inhibitorias como cebolla en polvo, ajo, orégano, pimientos, algunos tés y cafés, premezclas vitamínicas o productos muy salados.
- Una muestra de laboratorio mayor que el máximo se divide: 750 g se procesan como dos porciones de 375 g.
Además, el tamaño mayor tiene que estar validado. Si lo fue en un estudio según ISO 16140-2 o ISO 16140-5, cada laboratorio solo necesita verificarlo según ISO 16140-3 dentro de la misma categoría de alimento; si no, debe validarlo por sí mismo con el protocolo del anexo H de la enmienda 1:2024 de ISO 16140-4, demostrando con el nivel relativo de detección (RLOD) que el LOD50 no empeora. Una vez validados 375 g, pueden usarse porciones menores a la misma proporción. Estos conceptos se explican en validación y verificación de métodos.
La evidencia respalda el enfoque cuando se hace bien. Tomás Fornés y colaboradores validaron el agrupamiento de porciones hasta 375 g para Salmonella con cinco métodos (cultivo, ELISA y PCR en tiempo real) en 23 alimentos (confitería, fórmula infantil, alimento para mascotas, bebidas en polvo, entre otros). En 22 de los 23 el RLOD50 frente a 25 g fue aceptable (menor a 2,5), con la condición de precalentar el caldo y respetar el tiempo máximo de incubación. El agrupamiento también aparece en la regulación: el Reglamento (CE) 2073/2005 pide unir la piel de cuello de al menos tres canales de ave de la misma manada de origen en una muestra de 26 g, y agrupar los hisopados de distintos sitios de una canal antes del análisis. Cómo se leen n y c en esos planes está en planes de muestreo por atributos, y por qué la etapa de caldo es decisiva, en enriquecimiento microbiológico.
Qué kits y medios de TAAG se relacionan
El kit define para qué porción está validado. En el catálogo de TAAG, Elevia 1.1 Salmonella spp. (V-PAT04, RT-qPCR con tecnología AiGOR) declara una sensibilidad de 1 UFC/375 g en alimentos y 1 UFC/muestra en superficies; su certificación AOAC cubre porciones de 375 g de chocolate 62 % cacao, licor de cacao, leche en polvo descremada y maní, y TAAG declara además matrices validadas como chocolates con relleno, carne molida (90 % magra), alimento balanceado en pellets, huevo líquido pasteurizado y superficies de acero inoxidable. Su ficha lista el suplemento Potentia 1 Salmonella spp. (V-PET06), un potenciador de crecimiento para agua peptonada tamponada. Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97, PCR en tiempo real) declara 1 UFC/25 g, con matrices validadas de muslo de pollo crudo, hamburguesa de carne congelada, salchicha tipo longaniza, mortadela y superficies, y se asocia a Augmentis 14 Universal Gram negative (V-FL46, frascos de 225 mL, el volumen de caldo para 25 g a 1:10). Usar un kit con una porción, una matriz o un esquema de agrupamiento distintos de los declarados exige la verificación o validación que pide la enmienda de ISO 6887-1. Para elegir según matriz, ver cómo elegir un kit de TAAG.
Conclusión
La preparación de la muestra decide qué representa un resultado tanto como el método de detección. ISO 6887-1 fija la suspensión inicial 1:10, diluyentes controlados, homogeneización sin calentar la muestra y un máximo de 45 minutos hasta la siembra, y las partes 2 a 6 ajustan esas reglas a carnes, pescados, lácteos, productos secos y producción primaria. Componer o agrupar porciones para patógenos es una herramienta válida y respaldada por evidencia, pero solo con unidades del mismo lote, caldo precalentado, proporción constante y un tamaño de porción validado. Dejar estas decisiones por escrito en el procedimiento del laboratorio es lo que permite comparar resultados entre turnos, analistas y laboratorios.
Sobre TAAG
Consulta con TAAG si Elevia 1.1 Salmonella spp. o Ampliora 1.1 Salmonella spp. están validados para la porción analítica y el esquema de pooling que usa tu laboratorio.
Preguntas frecuentes
¿Por qué la suspensión inicial se prepara a 1:10?
Porque ISO 6887-1 define la dilución primaria como la porción analítica mezclada con, normalmente, nueve veces su cantidad de diluyente, lo que da la base de una serie decimal. La norma admite otras proporciones, como 1 en 20 o 1 en 100 para productos espesos, siempre que se tengan en cuenta en el cálculo del resultado.
¿Cuánto tiempo puede esperar una suspensión antes de sembrarse?
Según ISO 6887-1, no más de 45 minutos desde el final de la suspensión inicial hasta que el inóculo toca el medio final, y no más de 30 minutos hasta empezar las diluciones. Si el laboratorio supera los 27 °C, esos tiempos deberían acortarse. El BAM del FDA fija un máximo de 15 minutos desde la homogeneización hasta tener todas las diluciones en sus medios.
¿Qué diferencia hay entre una muestra compuesta y una agrupada?
En la compuesta se mezclan varias unidades y se analiza una porción del tamaño del método, por ejemplo 25 g, y el resultado se expresa en 25 g. En la agrupada se analiza la mezcla completa, por ejemplo 375 g, y el resultado se expresa en esa masa total. Ambas son solo para ensayos cualitativos y con unidades del mismo lote.
¿Se puede analizar 375 g en lugar de 25 g para Salmonella?
Sí, si el método está validado para esa porción mayor y se respetan las condiciones de la enmienda 1:2024 de ISO 6887-1: caldo precalentado, perfil de temperatura conocido y la misma proporción muestra/diluyente. Si el tamaño no fue validado según ISO 16140-2 o 16140-5, el laboratorio debe validarlo con el protocolo del anexo H de la enmienda de ISO 16140-4.
¿Cómo se descongela una muestra antes del análisis?
ISO 6887-1 permite dejar los envases pequeños a 18-27 °C hasta 3 horas o a 5 ± 3 °C hasta 24 horas, y desaconseja el baño de agua o el chorro de agua fría. El BAM prefiere no descongelar y, si hace falta, usa 2-5 °C en un máximo de 18 horas o menos de 45 °C durante no más de 15 minutos con agitación.