Parte del pilar de patógenos alimentarios. Aquí el protagonista no es una bacteria: para entender cómo se lee una señal de RT-PCR, conviene haber visto antes los controles de una PCR y el valor Ct.
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Un patógeno que no crece en el laboratorio
Casi todo lo que se sabe sobre análisis microbiológico de alimentos parte de una idea simple: si la bacteria está en la muestra, se la hace multiplicar en un medio de cultivo y se la cuenta o se la detecta. Con los virus entéricos esa lógica no funciona. Los virus no se multiplican en los alimentos: necesitan una célula huésped, y lo que hay en un lote de ostras, de frambuesas o de lechuga son partículas que llegaron allí y esperan.
El norovirus y el virus de la hepatitis A (VHA) son los dos virus más relevantes en inocuidad alimentaria. El informe FAO/OMS de 2008 sobre virus en alimentos los describe como los virus transmitidos por alimentos más importantes, y señala que los alimentos implicados suelen ser los mínimamente procesados, como los moluscos bivalvos y los productos frescos, más que los industrializados. Este artículo explica por qué detectarlos es distinto a buscar Salmonella, cómo lo hacen las normas ISO 15216 y qué se puede y qué no se puede concluir de un resultado positivo.
Por qué no se cultivan
Una revisión sobre virus transmitidos por alimentos publicada en 2018 en el International Journal of Food Microbiology (Bosch y colaboradores) resume la situación: a pesar de numerosos intentos con monocapas y estructuras tridimensionales de distintas líneas celulares, no se logró una replicación reproducible del norovirus humano in vitro. Para el VHA, las cepas silvestres tampoco se cultivan con facilidad; existe una cepa adaptada al laboratorio (HM-175) que se usa en estudios de investigación.
Hubo avances. En 2016, un grupo describió en la revista Science la replicación de varias cepas de norovirus humano en enteroides intestinales derivados de células madre, con la bilis como factor necesario. Es una herramienta de investigación valiosa para estudiar infectividad, pero no es un método de rutina que un laboratorio de alimentos pueda aplicar a un lote.
La consecuencia práctica es que el recuento en placa, que sigue siendo la referencia para muchas bacterias (ver cultivo microbiológico tradicional), no existe para estos virus. Tampoco hay una etapa de enriquecimiento que los haga crecer. Lo que se detecta es su material genético: ARN, mediante transcripción reversa seguida de PCR en tiempo real (RT-qPCR).
Cómo llegan los virus al alimento
Manipuladores infectados
Una persona infectada elimina grandes cantidades de virus por las heces, y en el caso del norovirus también por el vómito. Según los CDC, el norovirus puede seguir transmitiéndose dos semanas o más después de que la persona se sienta mejor. El VHA puede transmitirse hasta dos semanas antes de que aparezcan síntomas, e incluso por personas que nunca los desarrollan. En un análisis de brotes de gastroenteritis en Estados Unidos entre 2009 y 2012, citado por la revisión de Bosch, los restaurantes fueron el ámbito más frecuente de brotes de norovirus y en la mayoría la causa se atribuyó a manipuladores infectados (70 %).
Moluscos bivalvos
Ostras, almejas y mejillones filtran grandes volúmenes de agua y concentran los virus que esta contenga si recibió aguas residuales. Se consumen a menudo crudos o apenas cocidos. Los CDC advierten que cualquier persona que consume mariscos crudos corre riesgo de contraer norovirus. La revisión de Bosch añade que los virus entéricos pueden persistir semanas o meses en los moluscos. Para el contexto bacteriano de este mismo grupo de alimentos, ver Vibrio en mariscos y acuicultura.
Berries y hortalizas
Las frutas blandas y los vegetales de hoja se consumen sin cocción y pueden contaminarse por agua de riego, por manos durante la cosecha o por el procesamiento. La congelación no los elimina: la misma revisión recoge una reducción menor a 1,2 log10 en fresas, enteras y en puré, tras 28 días de almacenamiento congelado. Un ejemplo documentado es el brote de gastroenteritis por norovirus de septiembre y octubre de 2012 en Alemania, que afectó a unas 11.000 personas y cuyo vehículo fue, según los estudios epidemiológicos, una partida de fresas congeladas. Maunula y colaboradores detectaron norovirus en 7 de 11 muestras de esa partida, con tres genotipos distintos, lo que sugirió contaminación a partir de aguas residuales más que de un único manipulador. El riesgo del producto fresco en general se desarrolla en microbiología en frutas y vegetales frescos.
¿Con qué frecuencia aparecen estos virus en berries? Un metaanálisis de 2024 estimó una prevalencia de norovirus y VHA de 2,12 % (IC 95 %: 1,74-2,59 %), con una heterogeneidad alta entre estudios, por lo que los autores piden tomar la cifra con cautela. También observaron una tendencia decreciente en el tiempo y una prevalencia mayor en berries de origen africano que en las de otros continentes.
Dosis mínimas y por qué importan
La revisión de Bosch cita estimaciones de dosis infectiva del norovirus en un rango de 15 a 1.300 copias genómicas, o de 1 a 10 partículas virales. Con una dosis tan baja, una contaminación que sería irrelevante para una bacteria que necesita multiplicarse puede bastar para enfermar. Los CDC indican que los síntomas del norovirus aparecen entre 12 y 48 horas después de la exposición; en el caso de la hepatitis A, la incubación va de 2 a 7 semanas, lo que complica rastrear el alimento responsable.
ISO 15216: el método de referencia
La detección de VHA y norovirus en alimentos se rige por la serie ISO 15216, "Microbiología de la cadena alimentaria. Método horizontal para la determinación del virus de la hepatitis A y norovirus mediante RT-PCR en tiempo real". Tiene dos partes:
- ISO 15216-1:2017 es el método de cuantificación. Se aplica a frutas blandas, hortalizas de hoja, tallo y bulbo, agua embotellada, moluscos bivalvos y superficies. Un estudio de validación con 18 laboratorios de 11 países europeos, realizado entre 2012 y 2014 sobre siete matrices, generó los límites de detección y cuantificación y los valores de repetibilidad y reproducibilidad que se incorporaron a la edición de 2017 (Lowther y colaboradores).
- ISO 15216-2:2019 es el método de detección, es decir, presencia o ausencia del genoma viral en la porción analizada.
El flujo general tiene tres etapas. Primero, los virus se liberan o se eluyen del alimento y se concentran; el procedimiento depende de la matriz. Después, el ARN viral se extrae con tiocianato de guanidina y se adsorbe en sílice. Por último, se amplifica y detecta por RT-qPCR con sondas específicas para norovirus de los genogrupos I y II y para VHA. La parte de extracción es la misma lógica que explicamos en extracción de ácidos nucleicos, con una dificultad añadida: el material de partida es muy escaso y la matriz, rica en inhibidores.
Los controles que hacen interpretable el resultado
La revisión de Bosch explica que el método incluye criterios pensados para evitar falsos negativos y la subestimación de la cantidad de virus, mediante dos controles que se suman a los de cualquier PCR (ver controles de una PCR):
- Control de proceso. Se agrega un virus de control a la muestra antes de procesarla para medir la eficiencia de la extracción. Un estudio de 2025 sobre berries congeladas procesadas con ISO 15216:2017 menciona un umbral mínimo de recuperación del 1 %. Sin este control, un negativo no se puede distinguir de una extracción que recuperó casi nada del virus.
- Control de inhibición. Se añade un ARN de control a la reacción de RT-qPCR para evaluar si el extracto contiene sustancias que frenan la amplificación. La presencia de inhibidores en la matriz es una de las dificultades señaladas para la detección sensible de estos virus en alimentos.
A ellos se suman el control positivo y el control sin molde de cualquier corrida. La lectura de cada curva sigue las reglas que describimos en valor Ct en PCR en tiempo real, y los resultados cercanos al límite de detección se interpretan con la cautela de límite de detección e incertidumbre.
Qué significa un positivo
Esta es la pregunta central y la que más se malinterpreta. La RT-qPCR detecta ARN viral; no distingue entre partículas infecciosas y no infecciosas. Un estudio de 2025 lo cuantificó en un modelo con norovirus murino, usado como sustituto del norovirus humano, inoculado en frambuesas congeladas y procesado con ISO 15216:2017. El límite de detección del cultivo celular fue de 3,1 log PFU/25 g, mientras que la RT-qPCR llegó a 1,0 log PFU/25 g (Ct de 36,7 ± 0,6): una diferencia de 2 log. Los autores concluyen que una parte sustancial de los genomas detectados no representa partículas infecciosas, y que los Ct altos, por encima de 35, pueden no indicar virus viable. Es un modelo de laboratorio con un sustituto, no una regla para todos los alimentos, pero ilustra la brecha.
Para la práctica, esto implica tres cosas:
- Un resultado positivo significa que el genoma viral fue detectado en la porción analizada. No demuestra que el alimento cause enfermedad ni que lo haya causado.
- Un resultado negativo vale solo para la porción analizada, y únicamente si los controles de proceso e inhibición fueron satisfactorios. Los virus se distribuyen de forma heterogénea: en el estudio alemán, la elección del método de extracción cambió la tasa de detección, y los autores destacan el papel del muestreo.
- La decisión de liberar, retener o retirar un lote combina el resultado de laboratorio con la evidencia epidemiológica, el origen del producto y los antecedentes de la zona de producción o del proveedor. Es la misma idea de resultado presuntivo frente a confirmado, con la salvedad de que aquí no existe un cultivo que confirme viabilidad.
Esta limitación también explica por qué el método molecular para virus es distinto de los enfoques con ARN de células vivas que tratamos en RNA vs. ADN: el ARN viral detectado por ISO 15216 es genoma presente, no una señal de actividad metabólica.
Vigilancia en moluscos y relación con brotes
Los criterios microbiológicos aplicados hoy a los moluscos bivalvos son bacteriológicos. La EFSA, en su opinión científica de 2011 sobre virus transmitidos por alimentos, recomendó introducir criterios microbiológicos para virus en moluscos bivalvos, salvo que estén etiquetados para cocinarse antes del consumo, y subrayó que los controles deben centrarse en prevenir la contaminación más que en intentar eliminarla del alimento.
En 2019, la EFSA analizó la encuesta europea de referencia sobre norovirus en ostras: 2.180 muestras válidas de zonas de producción y 2.129 de centros de expedición, tomadas durante dos años. La prevalencia fue de 34,5 % (IC 95 %: 30,1-39,1 %) en zonas de producción y de 10,8 % (IC 95 %: 8,2-14,4 %) en lotes de centros de expedición, con una marcada estacionalidad (más contaminación entre noviembre y abril) y menor contaminación en zonas clase A. Los resultados superaron el límite de cuantificación en menos del 10 % de las muestras. La EFSA concluyó que los criterios bacteriológicos actuales podrían complementarse con un criterio para norovirus, aunque un límite cercano o inferior al límite de cuantificación sería difícil de aplicar, y aclaró que el estudio evaluó la capacidad analítica y no el riesgo para la salud.
Cuando hay un brote, el laboratorio de alimentos suele ser una pieza más junto con la investigación epidemiológica. Una detección en el alimento sirve más cuando puede tiparse y compararse con la de los pacientes, como ocurrió en Alemania, donde el genotipo hallado en las fresas también apareció en algunos enfermos. Esa comparación entre aislados es el mismo principio que describimos en secuenciación genómica de brotes.
Prevención: lo que el análisis no reemplaza
Los análisis de virus en alimentos son una herramienta de verificación y de investigación, no el control principal. La EFSA recomienda centrar los controles en evitar la contaminación viral, en lugar de intentar eliminar o inactivar los virus del alimento ya contaminado. Eso apunta a la higiene del personal y al origen del agua y de las materias primas. Los CDC, por su parte, recomiendan lavar las manos con cuidado, cocinar bien los mariscos y lavar los productos frescos, y señalan la vacunación como la principal medida de prevención de la hepatitis A. Estas medidas se integran en las buenas prácticas de manufactura y en el plan HACCP.
Sobre la oferta de kits: el catálogo de TAAG no incluye hoy kits para norovirus ni para hepatitis A. Si tu programa de control los requiere, conviene consultarlo con el equipo técnico de TAAG.
Conclusión
El norovirus y el virus de la hepatitis A no se multiplican en los alimentos ni se cultivan en el laboratorio de rutina, así que se detectan por su ARN mediante RT-qPCR, con los métodos ISO 15216-1 (cuantificación) e ISO 15216-2 (detección). Los controles de proceso e inhibición son los que permiten interpretar un negativo, y un positivo indica genoma detectado, no virus infeccioso demostrado. Por eso el resultado se lee junto con la epidemiología, el muestreo y las medidas de prevención, que siguen siendo la principal barrera frente a estos virus.
Sobre TAAG
Si tu programa de inocuidad incluye moluscos, berries u hortalizas de consumo en fresco, consulta con el equipo técnico de TAAG cómo se articulan los controles de patógenos bacterianos con el resto de tu plan de verificación.
Preguntas frecuentes
¿Por qué el norovirus no se puede cultivar como una bacteria?
Los virus necesitan una célula huésped para replicarse. Para el norovirus humano no se ha logrado una replicación reproducible en las líneas celulares habituales; en 2016 se describió su replicación en enteroides intestinales humanos, pero es una herramienta de investigación y no un método de rutina para alimentos. Por eso se detecta su ARN por RT-qPCR.
¿Qué normas regulan la detección de norovirus y hepatitis A en alimentos?
La serie ISO 15216: la parte 1 (2017) describe la cuantificación por RT-PCR en tiempo real y la parte 2 (2019) la detección de presencia o ausencia. Se aplican a frutas blandas, hortalizas, agua embotellada, moluscos bivalvos y superficies.
¿Un positivo por RT-PCR significa que el alimento tiene virus infecciosos?
No necesariamente. La RT-qPCR detecta ARN viral y no distingue partículas infecciosas de no infecciosas. En un modelo con norovirus murino en frambuesas congeladas, la RT-qPCR fue 2 log más sensible que el cultivo celular, lo que indica que parte del genoma detectado no corresponde a virus infeccioso.
¿Qué controles necesita el método para virus en alimentos?
Además de los controles de cualquier PCR, ISO 15216 incluye un control de proceso, un virus agregado a la muestra para medir la eficiencia de la extracción, y un control de inhibición, un ARN añadido a la reacción para detectar sustancias que frenan la amplificación.
¿Con qué frecuencia se encuentra norovirus en ostras?
En la encuesta europea analizada por la EFSA en 2019, el 34,5 % de las muestras de zonas de producción y el 10,8 % de los lotes de centros de expedición fueron positivos, con más contaminación entre noviembre y abril. Menos del 10 % de las muestras superó el límite de cuantificación.