Este artículo baja a la matriz alimentaria lo que se presenta en controles de una PCR y en extracción de ácidos nucleicos.
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Un negativo que no siempre significa ausencia
En una PCR en tiempo real, un resultado negativo es la falta de una curva que sube. Esa falta puede deberse a que el microorganismo no estaba en la muestra, pero también a que algo del alimento impidió que la reacción funcionara. A esas sustancias se les llama inhibidores de la PCR. La revisión de Sidstedt, Rådström y Hedman (2020) las define como moléculas de la matriz, de las propias células o de los reactivos agregados durante la preparación que afectan la polimerización del ADN o la señal de fluorescencia.
Para un laboratorio de alimentos el riesgo es concreto: un inhibidor que pasa sin ser detectado convierte un lote contaminado en un informe "no detectado". Este artículo se centra en la matriz: qué componentes de los alimentos inhiben, cómo se reconoce la inhibición y qué se puede hacer para evitarla. Los controles de una corrida se explican en detalle en controles de una PCR y las etapas de purificación en extracción de ácidos nucleicos.
Tres formas de bloquear una reacción
Sidstedt y colaboradores ordenan los mecanismos en tres grupos. Distinguirlos ayuda a elegir la solución correcta.
Inhibidores de la polimerasa
Actúan directamente sobre la enzima, uniéndose a ella o degradándola, o alterando el contenido de iones que necesita. La hemoglobina y la hematina, derivadas del grupo hemo de la sangre, reducen la actividad de la polimerasa y con ello la eficiencia de amplificación. Las sales biliares y el ácido fítico presentes en heces también se describen como inhibidores directos de la enzima, y los fenoles arrastrados desde una purificación pueden desnaturalizarla.
Inhibidores que se unen a los ácidos nucleicos
Otros compuestos se unen al ADN molde e impiden que los primers se anclen o que la enzima avance. Es el caso de la inmunoglobulina G de la sangre, que se une al ADN de cadena simple y retrasa el inicio de la amplificación, y del colágeno del hueso, que interactúa con el ADN molde.
Inhibidores de la detección
Algunas moléculas no frenan la amplificación, sino que apagan la fluorescencia. En los estudios revisados, el ácido húmico y la hemoglobina atenuaron la señal de colorantes que se unen al ADN de doble cadena (SYBR Green I, EvaGreen) y del colorante de referencia ROX, mientras que, frente al ácido húmico, la detección con sondas de hidrólisis no mostró ese efecto. En la práctica, puede haber producto amplificado y aun así una curva débil o ausente. La química de cada línea de kits se describe en Ampliora, Elevia y Specio: qué química usa cada una.
Los inhibidores típicos de cada matriz
Cacao, chocolate y especias: polifenoles
El chocolate y la pimienta negra se usan como inhibidores de referencia en la investigación sobre polimerasas. En un trabajo de 2025, Kermekchiev y colaboradores prepararon soluciones acuosas de chocolate amargo (70 % de cacao) y de pimienta negra y comprobaron que fracciones de microlitro de esas soluciones inhibían de forma importante o completa a la Taq polimerasa convencional al amplificar un gen de Salmonella. Los autores consideran plausible que compuestos fenólicos y polifenólicos sean un inhibidor común al chocolate, la pimienta, los extractos vegetales y el ácido húmico.
En muchos materiales vegetales, a los polifenoles se suman los polisacáridos. Los protocolos de extracción para plantas ricas en ambos grupos de compuestos los tratan por separado: una concentración alta de sal (1,4 M) para que los polisacáridos no pasen al extracto y polivinilpirrolidona (PVP) para retener los polifenoles, según describen Rezadoost y colaboradores (2016). La relación de estas matrices con Salmonella se trata en Salmonella en alimentos de baja humedad.
Leche y quesos: el calcio, más que la grasa
Una intuición común es atribuir la inhibición de la leche a su grasa. Bickley y colaboradores (1996) observaron que, sin tratamiento previo, la amplificación de Listeria monocytogenes fallaba con más de 5 % de leche en la reacción, y que la inhibición aparecía en las mismas concentraciones con leche entera, semidescremada y descremada. El principal responsable identificado fueron los iones de calcio. El efecto se revirtió en parte aumentando el magnesio de la reacción muy por encima de lo habitual, lo que apunta a una competencia con el magnesio que necesita la polimerasa. El queso también figura entre las muestras inhibidoras conocidas con las que Al-Soud y Rådström (1998) compararon nueve polimerasas.
Carne, sangre y muestras fecales
En carnes y productos cárnicos la sangre aporta hemoglobina, hematina, inmunoglobulina G y lactoferrina, todas descritas como inhibidoras. Rossen y colaboradores (1992) encontraron además que la PCR era sensible a volúmenes grandes de muestras de alimentos complejos con mucha grasa y proteína. En muestras con contenido fecal, como las de producción primaria, se suman las sales biliares y el ácido fítico mencionados antes.
El propio laboratorio también aporta inhibidores
No todo viene del alimento. Rossen y colaboradores comprobaron que algunos caldos de cultivo (Fraser, Rappaport, MLEB y MRB) interferían con la PCR, y que reactivos usados en la extracción, como detergentes, lisozima, NaOH, alcoholes o EGTA, tenían cierto efecto inhibidor. Por eso la combinación de caldo de enriquecimiento, método de extracción y reactivos de PCR debe evaluarse como un conjunto.
Cómo se detecta la inhibición
Qué pide la norma
Durante casi dos décadas el marco ISO estuvo repartido en varias normas: ISO 20837:2006 fijaba los requisitos para preparar muestras compatibles con la PCR e ISO 20838:2006 fijaba los requisitos de amplificación y detección para métodos cualitativos. Ambas, junto con ISO 22119:2011 e ISO 22174:2005, fueron reemplazadas por ISO 22174:2024 (segunda edición, agosto de 2024), que establece los requisitos generales para la PCR en microorganismos y virus de la cadena alimentaria, incluidos alimentos, piensos, muestras ambientales de producción y muestras de producción primaria. Quien todavía cite ISO 20837 o ISO 20838 en un procedimiento interno debería actualizar la referencia.
El control interno de amplificación y sus límites
La herramienta habitual es el control interno de amplificación (IAC), una secuencia ajena al blanco que se amplifica en el mismo tubo. Su lógica de lectura está en controles de una PCR. Desde el punto de vista de la matriz, conviene tener presentes dos matices que señala la revisión de Sidstedt:
- No todos los ensayos se inhiben igual. Distintos primers y blancos pueden verse afectados de forma diferente, y los fragmentos largos suelen ser más sensibles que los cortos. Un IAC bien diseñado debe reflejar la inhibición que sufriría el blanco.
- La inhibición parcial se ve en la curva. Además del IAC, se puede observar la cinética de amplificación del propio blanco. Un Ct que se atrasa o una eficiencia que cae son señales tempranas, como se explica en valor Ct en PCR en tiempo real.
En la validación de métodos el IAC aparece con frecuencia en matrices difíciles. McCabe y colaboradores (2011) validaron una PCR en tiempo real para Salmonella con un IAC coamplificado para vigilar inhibidores, y el método rindió igual que el cultivo de referencia en muestras contaminadas artificialmente de ensalada, chocolate, pescado y queso.
La muestra fortificada
El IAC verifica la amplificación, pero no la extracción ni el enriquecimiento. Para eso sirve una muestra de la misma matriz fortificada con el microorganismo (matrix spike). El capítulo de Salmonella del Manual Analítico Bacteriológico (BAM) de la FDA establece que, si una muestra fortificada da negativo en el screening molecular, la muestra debe continuar por cultivo.
Cómo se mitiga
Diluir
Es la medida más simple. El BAM indica que, ante resultados de screening sospechosos de inhibición, se repita el análisis con el ADN molde diluido. La dilución baja el inhibidor y el blanco en la misma proporción: sirve cuando el inhibidor deja de actuar por debajo de cierta concentración y todavía queda blanco suficiente. Si el blanco está cerca del límite de detección, diluir puede hacerlo invisible.
Enriquecer, y cuidar el pre-enriquecimiento
El enriquecimiento diluye la matriz y multiplica el blanco al mismo tiempo. En algunos alimentos el obstáculo no es solo la PCR sino el crecimiento: el BAM indica pre-enriquecer el chocolate en leche descremada reconstituida con verde brillante, analizar pimienta de Jamaica, canela y orégano en proporción 1:100 y el clavo de olor en 1:1.000, porque no existe un método conocido para neutralizar la toxicidad de esas especias, y agregar sulfito de potasio al caldo para cebolla y ajo. Si Salmonella no crece en el caldo, la PCR no tendrá nada que detectar.
Extraer mejor, sin perder ADN
Un pretratamiento o un kit de extracción pensado para matrices complejas retira inhibidores que la lisis simple deja pasar. Rossen y colaboradores redujeron de forma significativa el efecto de alimentos grasos y proteicos con un tratamiento con NaOH y SDS en caliente. Purificar tiene un costo: según Sidstedt y colaboradores, la recuperación de ADN en purificaciones extensas suele estar entre 10 % y 80 %, por lo que una limpieza excesiva también puede generar falsos negativos.
Elegir una polimerasa tolerante y ajustar la mezcla
Las polimerasas no toleran igual a los inhibidores. Al-Soud y Rådström (1998) compararon nueve enzimas: AmpliTaq Gold y Taq se inhibieron por completo con 0,004 % (v/v) de sangre, mientras HotTub, Pwo, rTth y Tfl amplificaron sin perder sensibilidad con 20 % de sangre. La polimerasa de Thermotoga maritima fue la más afectada por queso, heces y carne. Hoy existen además mutantes de Taq seleccionados por su resistencia al chocolate y a la pimienta. También ayudan los facilitadores: la albúmina sérica bovina (BSA), usada entre 0,2 y 20 µg por reacción, contrarresta varios inhibidores de la polimerización, aunque no corrigió el apagado de fluorescencia por ácido húmico, y la trehalosa estabiliza la enzima.
Validar en la matriz real
Ninguna de estas medidas reemplaza la validación: los efectos de matriz deben estudiarse con los tipos de muestra que el laboratorio realmente analiza. Cómo se organiza esa evaluación se explica en validación y verificación de métodos según ISO 16140.
Qué kits y productos de TAAG se relacionan
En el catálogo de TAAG hay dos productos orientados específicamente a la inhibición. Clarixa 1 (V-PET02) es un pretratamiento previo a la extracción para muestras de matrices de alta complejidad, descrito como reductor de inhibidores de PCR. Nucleia 2 Tez-Q Plus (V-EQ19) es un kit de extracción de ácidos nucleicos bacterianos para matrices complejas con alta concentración de inhibidores. Entre los kits de detección, Elevia 1.1 Salmonella spp. (V-PAT04, RT-qPCR con sondas) declara como matrices validadas chocolates con relleno, barra de chocolate con maní, crema de avellana y cacao, carnes, alimento balanceado en pellets, huevo líquido pasteurizado y superficies de acero inoxidable, y su ficha lista como insumos de extracción Magneus 6 Bacteria y Nucleia 8 Ultra. Specio 00.1 Bacteria (V-SF14), un kit de alteración con curva de melting, declara entre sus matrices leche chocolatada, kétchup, mostaza y leche fortificada con calcio (130 mg/100 mL). Fuera de las matrices declaradas, el desempeño frente a inhibidores debe confirmarse con TAAG antes de usarlo en rutina.
Conclusión
Un falso negativo por inhibición no deja rastro si nadie lo busca, y cada matriz trae sus propios inhibidores: polifenoles en el cacao y las especias, calcio en la leche, hemo e inmunoglobulinas en la carne con sangre, sales biliares en muestras fecales, y hasta componentes de los propios caldos y reactivos. La inhibición se reconoce con un control interno de amplificación, con la lectura de la cinética de la curva y con muestras fortificadas, dentro del marco que hoy reúne ISO 22174:2024. Se mitiga combinando dilución, un enriquecimiento adecuado a la matriz, una extracción que limpie sin perder ADN y una polimerasa tolerante, y se demuestra validando el método en los alimentos que el laboratorio realmente analiza.
Sobre TAAG
Consulta con TAAG si Clarixa 1 o Nucleia 2 Tez-Q Plus encajan en tu matriz, y el alcance validado de Elevia 1.1 Salmonella spp. en cacao y chocolate.
Preguntas frecuentes
¿Qué es un inhibidor de la PCR?
Es cualquier sustancia de la muestra, de las células o de los reactivos que interfiere con la amplificación del ADN o con la lectura de la fluorescencia. Puede actuar sobre la polimerasa, unirse al ADN molde o apagar la señal. Su consecuencia más grave es un falso negativo.
¿Por qué el chocolate y las especias inhiben la PCR?
La inhibición se atribuye sobre todo a compuestos fenólicos y polifenólicos, que interfieren con la polimerasa. En un estudio de 2025 con chocolate amargo y pimienta negra, fracciones de microlitro de soluciones acuosas de esos alimentos bastaron para inhibir de forma importante o completa a la Taq polimerasa convencional.
¿La grasa de la leche es la que inhibe la PCR?
No principalmente. Bickley y colaboradores observaron la misma inhibición con leche entera, semidescremada y descremada, y atribuyeron el efecto sobre todo a los iones de calcio, que compiten con el magnesio de la reacción.
¿Siguen vigentes ISO 20837 e ISO 20838?
No. Ambas normas de 2006 fueron retiradas y reemplazadas por ISO 22174:2024, que reúne los requisitos generales de la PCR para microorganismos de la cadena alimentaria. Los procedimientos internos deberían citar esta última.
¿Qué hago si sospecho inhibición en una muestra?
Repetir el análisis con el ADN diluido es el primer paso que indica el BAM de la FDA. Si persiste, conviene mejorar la extracción o usar un pretratamiento para matrices complejas, y si el resultado sigue siendo indeterminado, completar el análisis por cultivo.