Número Mais Provável (NMP): como funciona, como ler suas tabelas e quando usá-lo em vez da contagem em placa

Contar sem ver colônias

A contagem em placa conta o que se vê: cada colônia sobre o ágar é assumida como uma unidade formadora de colônia, como se explica em o que são as UFC e como são interpretadas. O método do Número Mais Provável (NMP, ou MPN pela sigla em inglês) chega a um valor por outro caminho. Não conta colônias: distribui a amostra em vários tubos com caldo, observa quais mostram crescimento e, a partir dessa combinação de positivos e negativos, calcula a concentração que com maior probabilidade produziu esse resultado.

O Apêndice 2 do Bacteriological Analytical Manual (BAM) da FDA atribui a McCrady, em 1915, a primeira estimativa precisa de bactérias viáveis por essa via. O método continua vigente porque resolve situações em que a placa falha: concentrações baixas, alimentos com partículas que se confundem com colônias e microrganismos que precisam de um enriquecimento antes de poderem ser isolados.

O princípio estatístico

A ideia é diluir até que alguns tubos recebam pelo menos uma célula viável e outros nenhuma. Se as bactérias estão distribuídas ao acaso, o número de células que cai em cada tubo segue uma distribuição de Poisson, e a probabilidade de um tubo ficar sem células depende apenas da concentração e da quantidade de amostra inoculada. Com várias diluições decimais e vários tubos por diluição, o padrão de tubos positivos permite estimar a concentração original. O NMP é, literalmente, o valor de concentração que torna mais provável o resultado observado; a equação é resolvida por iteração.

Os pressupostos que devem ser cumpridos

O BAM enumera quatro condições para que a estimativa seja válida:

• As bactérias estão distribuídas ao acaso na amostra.
• Estão separadas, não agrupadas, e não se repelem entre si.
• Todo tubo que recebe ainda que um único organismo viável produz crescimento ou uma mudança detectável.
• Os tubos são independentes entre si.

O terceiro pressuposto é o mais exigente: o meio deve permitir que uma única célula, às vezes injuriada, cresça diante da microbiota acompanhante. Por isso a qualidade do caldo e da etapa de enriquecimento condiciona diretamente o resultado. Além disso, o NMP conta apenas organismos viáveis. Se as bactérias formam cadeias ou grupos que a diluição não separa, o BAM indica que o resultado deve ser lido como unidades de crescimento ou UFC, não como células individuais.

Séries de 3, 5 e 10 tubos

O desenho mais publicado são três diluições decimais consecutivas com 3, 5, 8 ou 10 tubos cada uma; o Apêndice 2 traz tabelas para esses desenhos, construídas para inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g. O capítulo 4 do BAM, sobre coliformes e E. coli, indica que a série de 3 tubos é usada para a maioria dos alimentos; que em moluscos bivalves não se devem usar menos de 5 tubos por diluição; e que existe um método de 10 tubos para água engarrafada ou amostras que não se espera estarem muito contaminadas.

Mais tubos significam mais informação por diluição e, portanto, intervalos mais estreitos e um limite inferior mais baixo. Com as tabelas do BAM e os inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g, o resultado com todos os tubos negativos é relatado como menor que 3,0 NMP/g na série de 3 tubos e como menor que 1,8 NMP/g na de 5 tubos. O limite superior do intervalo de confiança desse resultado nulo cai de 9,5 para 6,8 e, com 10 tubos, para 3,1 NMP/g.

Como as tabelas são lidas

O resultado é expresso como um código de três algarismos: o número de tubos positivos em cada uma das três diluições escolhidas. Na tabela de 3 tubos, o código 3-1-0 corresponde a 43 NMP/g, com um intervalo de confiança de 95 % de 9 a 180. Se os inóculos usados foram dez vezes menores que os da tabela (0,01, 0,001 e 0,0001 g), o valor e seus limites são multiplicados por 10: 430 NMP/g. A mesma regra funciona no sentido inverso: inocular quantidades maiores reduz o limite de quantificação.

Quando são semeadas mais de três diluições, o BAM descreve um procedimento para escolher as três que vão para a tabela. Em síntese, descartam-se as diluições mais altas que, junto com a anterior, tenham todos os tubos negativos, e busca-se a diluição mais alta com todos os tubos positivos. A FDA oferece ainda um aplicativo de cálculo e uma planilha para selecionar diluições.

As tabelas omitem combinações tão improváveis que sugerem erro de laboratório ou contaminação. Se o código obtido não está na tabela, o BAM o trata como um resultado improvável: pode se dever a interferências nas diluições baixas ou à confirmação de poucas colônias, e se a causa não for conhecida, a estimativa pode não ser confiável.

Intervalos de confiança: o valor vem com uma faixa ampla

Um NMP deve sempre ser lido junto com seu intervalo. Na série de 5 tubos, o código 5-2-0 dá 49 NMP/g com um intervalo de 95 % de 15 a 150: o valor real pode estar em uma faixa que cobre um fator próximo de dez. O BAM define esse intervalo assim: antes de inocular os tubos, a probabilidade de que o intervalo resultante contenha a concentração real é de pelo menos 95 %. As tabelas usam uma modificação do método de de Man (1983); a planilha Excel da FDA usa uma aproximação normal ao logaritmo do NMP, de modo que seus intervalos podem não coincidir com os das tabelas.

Vários autores descreveram que o NMP tende a superestimar a concentração. O BAM cita o trabalho de Garthright (1993), que mostrou que esse viés não é apreciável quando os resultados são expressos em logaritmos, a forma habitual de comparar e combinar dados. Para entender como se combinam a incerteza, o limite de detecção e a decisão de conformidade, ver limite de detecção e incerteza de medição.

Onde o NMP é usado na indústria de alimentos

Coliformes e E. coli em alimentos

O método clássico do BAM tem três fases. Na presuntiva, as diluições são semeadas em caldo lauril sulfato triptose (LST) e incubadas a 35 °C; registra-se a produção de gás em 24 e em 48 horas. Na confirmativa para coliformes, cada tubo com gás passa para caldo verde brilhante bile lactose (BGLB) a 35 °C, e, para coliformes fecais e E. coli, para caldo EC a 44,5 °C. A fase completa para E. coli acrescenta isolamento em ágar L-EMB e provas bioquímicas (IMViC). O NMP é calculado com a proporção de tubos confirmados em três diluições consecutivas. O capítulo lembra que coliforme não é uma categoria taxonômica, mas uma definição de trabalho. O que cada grupo indica na água é explicado em coliformes totais, E. coli e enterococos.

E. coli em moluscos bivalves: ISO 16649-3

É o caso em que o NMP é o método fixado pela norma. O Regulamento (CE) 2073/2005 estabelece para moluscos bivalves vivos, e para equinodermes, tunicados e gastrópodes marinhos vivos, um critério de segurança de E. coli com n = 5, c = 1, m = 230 e M = 700 NMP por 100 g de carne e líquido intervalvar, durante a vida útil, com EN/ISO 16649-3 como método de referência. O lote é satisfatório se os cinco valores forem 230 ou menos, ou se apenas um estiver entre 230 e 700.

O protocolo genérico do Centro de Referência da FAO, baseado na ISO 16649-3, descreve o método como um NMP de duas etapas com 5 tubos e 3 diluições. Primeiro, o homogeneizado de molusco é semeado em caldo glutamato com minerais modificado e incubado a 37 °C por 24 horas; depois, os tubos com produção de ácido são subcultivados em ágar com um substrato cromogênico de β-glucuronidase (TBX) a 44 °C. O limite teórico de detecção é de 18 E. coli por 100 g, e com três diluições o resultado máximo relatável é maior que 18.000. As cepas β-glucuronidase negativas, como E. coli O157, não são detectadas. O mesmo documento assinala que a norma Codex 292-2008 identifica esse método, ou um equivalente, para moluscos bivalves vivos ou crus.

Salmonella quantitativa em carcaças e pele de pescoço

Para Salmonella, a detecção (ausência em 25 g) responde se o patógeno está presente; o NMP responde quanto há. A especificação técnica ISO/TS 6579-2:2012 descreve um NMP miniaturizado em placas de 12 poços: três poços por diluição, diluições sucessivas em água peptonada tamponada e subcultivo em meio semissólido MSRV a 41,5 °C, com confirmação em ágar XLD. A norma reconhece seu limite: o limite de detecção é de aproximadamente 1 UFC/g, frente a 1 UFC em 25 g (0,04 UFC/g) do método de detecção, e não é apropriado para amostras com menos de 1 UFC/g, para as quais recomenda um NMP convencional.

Um estudo publicado na Poultry Science em 2024 aplicou esse NMP miniaturizado a 96 amostras compostas de pele de pescoço, que representavam 480 carcaças de frango. Encontrou Salmonella em 97,9 % das amostras antes do resfriamento e em 85,4 % depois, com contagens médias de 1,84 e 1,48 log NMP/g. Um resultado de presença não teria mostrado essa redução. Esse tipo de quantificação serve para avaliar etapas de processo, como se vê em Salmonella em carne de frango.

Listeria monocytogenes em amostras positivas

O capítulo 10 do BAM pede a enumeração de L. monocytogenes quando um alimento dá positivo, usando uma porção de reserva e combinando NMP e semeadura direta. O NMP é montado com 50 g de amostra em 450 ml de caldo de enriquecimento para Listeria tamponado (BLEB) e quatro diluições com três tubos cada uma, equivalentes a 10, 1, 0,1 e 0,01 g de amostra. Em 48 horas, cada tubo é semeado para isolamento e confirmação, ou triado com um método rápido aprovado e os presuntivos são confirmados; o resultado é interpretado com as tabelas do Apêndice 2. Se todos os tubos forem positivos, vale a contagem por semeadura direta.

NMP frente à contagem em placa (UFC)

Não são rivais, mas ferramentas para faixas e matrizes diferentes:

• Sensibilidade em contagens baixas. O BAM assinala que o NMP é particularmente útil para concentrações baixas, menores que 100 por grama, sobretudo em leite e água. Cada tubo pode receber vários gramas, o que reduz o limite inferior.
• Matrizes difíceis. Em alimentos com partículas que interferem na contagem de colônias, o tubo com caldo evita o problema de distinguir colônias de restos de alimento.
• Recuperação de células injuriadas. O caldo funciona como uma etapa prévia de crescimento, o que favorece células estressadas por calor, frio ou desinfetantes, desde que o meio seja adequado.
• Precisão. É o ponto fraco: os intervalos do NMP são amplos, de modo que dois resultados que parecem diferentes podem não diferir estatisticamente. Uma placa bem contada em sua faixa útil é, em geral, mais precisa.
• Trabalho e tempo. Muitos tubos, várias transferências e confirmações de 48 horas ou mais. A cultura tradicional em placa é mais direta se a carga esperada for alta.
• Confirmação. Nos métodos para patógenos, um tubo com crescimento é presuntivo até ser confirmado (ver resultado presuntivo vs. confirmado).

Quais kits da TAAG se relacionam com este método

A TAAG não tem um kit de NMP: seus kits de PCR em tempo real são qualitativos (detecção e identificação) e não fornecem um número de microrganismos por grama. Onde podem ter um papel é na leitura de tubos ou poços, como admite o capítulo 10 do BAM para o NMP de Listeria. No catálogo há kits para os microrganismos quantificados por NMP: o Specio 1.3 E. coli (V-SF167), com matrizes declaradas de alimentos, bebidas e superfícies vivas e inertes; o Ampliora 1.3 E. coli (V-SF69), para hortaliças folhosas e superfícies; o Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97), com sensibilidade declarada de 1 UFC/25 g em coxa de frango crua, hambúrguer bovino congelado, linguiça (longanicilla), mortadela e superfície; e o Ampliora 2.3 Listeria spp. and L. monocytogenes (V-SF46), para alimentos, bebidas e superfícies. Nenhum declara moluscos bivalves como matriz validada, e seus meios de enriquecimento associados não são os caldos de um NMP normalizado (MMGM, BLEB ou MSRV). Usar um kit para ler tubos de um NMP requer validar esse uso com o caldo e a matriz concretos; convém revisar isso com a TAAG antes de incorporá-lo a um procedimento.