Parte do pilar de fundamentos e padronização do Centro de Aprendizagem TAAG. Complementa o guia sobre a certificação AOAC-PTM e o de cultivo microbiológico tradicional.
Índice do artigo
Duas perguntas distintas sobre um mesmo método
Antes de usar um método microbiológico na rotina, um laboratório precisa responder a duas perguntas. A primeira é se o método funciona: se detecta ou quantifica o microrganismo-alvo com um desempenho aceitável frente a uma referência reconhecida. A segunda é se funciona em suas mãos, com sua equipe, seus equipamentos e os alimentos que analisa todos os dias. A primeira pergunta é respondida pela validação; a segunda, pela verificação.
A distinção não é um tecnicismo. A norma ISO/IEC 17025:2017, que rege a competência dos laboratórios de ensaio, exige que o laboratório verifique que pode aplicar corretamente um método antes de introduzi-lo, demonstrando que alcança o desempenho requerido e mantendo os registros. Um método validado que ninguém verificou no laboratório que o usa deixa uma lacuna que costuma aparecer nas auditorias. Os requisitos de acreditação são desenvolvidos no artigo sobre ISO/IEC 17025 em laboratórios de alimentos.
Validação: estabelecer o desempenho do método
A validação consiste em determinar as características de desempenho de um método e fornecer evidência objetiva de que ele cumpre os requisitos para um uso pretendido. Em microbiologia de alimentos isso significa, quase sempre, comparar um método alternativo (por exemplo, um kit de PCR ou um meio cromogênico) com um método de referência, que costuma ser um protocolo de cultivo tradicional normalizado como a ISO 6579-1 para Salmonella.
A série ISO 16140
O comitê técnico ISO/TC 34/SC 9 substituiu a antiga ISO 16140:2003 por uma série de normas, cada uma pensada para um cenário distinto:
- ISO 16140-1:2016: vocabulário comum de validação.
- ISO 16140-2:2016: protocolo para validar métodos alternativos, em sua maioria comerciais, frente a um método de referência. Tem uma emenda publicada em 2024 que revisou parte dos cálculos.
- ISO 16140-3:2021: protocolo para verificar, em um único laboratório, métodos de referência e métodos alternativos já validados.
- ISO 16140-4: validação em um único laboratório. Seus resultados só são válidos para o laboratório que realizou o estudo.
- ISO 16140-5: validação interlaboratorial fatorial para métodos não comerciais, com menos laboratórios participantes que na parte 2.
- ISO 16140-6:2019: validação de métodos alternativos de confirmação e tipificação, que partem de uma colônia suspeita e não de uma amostra de alimento.
A série é completada pela ISO 17468, que fixa os requisitos técnicos para estabelecer ou revisar um método de referência normalizado.
O que inclui uma validação segundo a ISO 16140-2
O protocolo tem duas fases. A primeira é um estudo comparativo realizado em um laboratório organizador: analisam-se amostras contaminadas com ambos os métodos para medir a sensibilidade, determina-se o nível de detecção relativo (RLOD) e verificam-se a inclusividade e a exclusividade com 50 cepas do microrganismo-alvo e 30 cepas não alvo. Nos métodos quantitativos, o estudo comparativo avalia a veracidade relativa e o perfil de exatidão. A segunda fase é um estudo interlaboratorial, no qual vários laboratórios analisam as mesmas amostras para estimar a reprodutibilidade do método.
O escopo da validação depende das categorias de alimentos estudadas. Para declarar um método válido para uma "ampla gama de alimentos" devem ser cobertas pelo menos cinco categorias. Essa declaração de escopo é a primeira coisa que convém revisar em um certificado.
Quem certifica
Na Europa, organismos independentes como MicroVal, NF Validation (AFNOR) e NordVal (NMKL) emitem certificados baseados na ISO 16140-2 e publicam os relatórios em seus sites. Nos Estados Unidos o esquema mais difundido é o da AOAC International, que explicamos no guia sobre a certificação AOAC-PTM.
O que diz a regulamentação europeia
O Regulamento (CE) 2073/2005 estabelece em seu artigo 5 que os métodos analíticos do anexo I são os de referência, e que o uso de métodos alternativos é aceitável quando estão validados frente a essa referência e, se são comerciais, certificados por um terceiro segundo o protocolo da EN ISO 16140 ou outros protocolos semelhantes aceitos internacionalmente. O Regulamento (UE) 2019/229 acrescentou definições-chave: o que se entende por "ampla gama de alimentos" e o que é um organismo de certificação independente do fabricante do método.
Verificação: demonstrar que o método funciona no seu laboratório
A ISO 16140-3 define a verificação como a demonstração de que um método validado funciona nas mãos do usuário conforme as especificações de sua validação. Divide o processo em duas etapas.
Etapa 1: verificação da implementação
O laboratório demonstra que sabe executar o método usando um único alimento, escolhido entre os analisados no estudo de validação. Se os resultados se assemelham aos da validação, o problema de fundo (a técnica) está resolvido.
Etapa 2: verificação dos alimentos do laboratório
Em seguida o laboratório demonstra que o método funciona com os alimentos que declara analisar. Para isso escolhe um alimento "difícil" de cada categoria incluída em seu escopo: produtos com baixa atividade de água, com antimicrobianos naturais como as especiarias, com lecitina, com muita gordura. O guia de formação do próprio comitê ISO mostra exemplos como sorvete, ovo em pó, carne temperada e cacau em pó.
O que se mede e com qual critério de aceitação
Métodos qualitativos: eLOD50
Nos métodos de detecção estima-se o nível de detecção a 50 % (eLOD50): a contaminação na qual o método dá positivo em metade das porções analisadas. Chama-se "estimado" porque a quantidade de amostras é muito menor que em uma validação completa. O critério de aceitação é que o eLOD50 obtido não ultrapasse quatro vezes o LOD50 da validação. No exemplo do guia de formação da ISO para Salmonella segundo a ISO 6579-1, o LOD50 de referência era de 5,7 UFC, o limite ficava em 22,8 UFC e o laboratório obteve 3,0 UFC, cumprindo o critério. O conceito de LOD50 é desenvolvido no artigo sobre limite de detecção e incerteza de medição.
Métodos quantitativos: reprodutibilidade e viés
Nas contagens, a verificação da implementação mede o desvio padrão de reprodutibilidade intralaboratorial (SIR), com um desenho alinhado à ISO 19036. O critério é que não ultrapasse o dobro do menor valor médio de reprodutibilidade obtido na validação. A verificação dos alimentos mede o viés estimado (eBias): contaminam-se porções em três níveis, em duplicata, e a diferença em relação ao nível esperado não deve ultrapassar 0,5 log10 em nenhum nível.
Métodos de confirmação e tipificação
Aqui exige-se apenas a verificação da implementação: testam-se cepas alvo e não alvo (no exemplo do guia, cinco de cada tipo) e exige-se 100 % de concordância com o resultado esperado.
O prazo de 2028 para os métodos de referência não validados
Muitas normas ISO de referência foram publicadas sem dados de desempenho. Para elas, a ISO 16140-3 oferece um protocolo transitório em seu anexo F. Segundo o documento de transição do comitê ISO, esse anexo pode ser usado até 31 de dezembro de 2027; a partir de 1º de janeiro de 2028, apenas os métodos de referência validados poderão ser verificados conforme a ISO 16140-3. As normas ISO são voluntárias, mas os organismos de acreditação costumam tomá-las como critério.
O mesmo documento esclarece quando é preciso verificar novamente. Um método já acreditado não precisa de nova verificação, a menos que mude. Um método novo ou uma categoria de alimentos nova dentro do escopo precisam. Se um método validado sofre uma mudança técnica maior com impacto relevante, também.
Se a verificação não for atendida
A norma pede uma análise de causa raiz antes de repetir. As causas habituais são o preparo e o nível do inóculo, a homogeneização da amostra, a calibração de equipamentos, lotes de meios ou reagentes e a aplicação do protocolo pelo analista. Se o problema persistir, o passo seguinte é consultar o fornecedor do método (se for comercial), o organismo de normalização (se for de referência) ou o organismo de certificação.
Erros comuns
- Dar por certo que um certificado de validação substitui a verificação no laboratório.
- Aplicar o método a alimentos de uma categoria que não está no escopo de sua validação.
- Verificar apenas com um alimento "fácil" e não com um representativo das dificuldades reais do laboratório.
- Não manter os registros de verificação, que são exigíveis sob a ISO/IEC 17025.
- Alterar uma etapa do protocolo, como o tempo de enriquecimento, e seguir tratando o método como validado.
Conclusão
Validar e verificar respondem a perguntas diferentes: se um método funciona e se funciona no seu laboratório. A série ISO 16140 organiza ambos os processos, desde a validação de métodos alternativos segundo a ISO 16140-2 até a verificação em um único laboratório segundo a ISO 16140-3, com critérios de aceitação concretos como o eLOD50 ou o eBias. Revisar o escopo do certificado, verificar com alimentos representativos e manter os registros evita que um método bem validado se torne um ponto fraco do laboratório.
Sobre a TAAG
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Perguntas frequentes
Qual a diferença entre validar e verificar um método microbiológico?
A validação estabelece o desempenho do método e demonstra que serve para um uso pretendido, normalmente comparando-o com um método de referência. A verificação demonstra que um laboratório concreto obtém esse desempenho ao aplicá-lo com seus próprios equipamentos, equipe e alimentos.
Um método com certificado MicroVal, NF Validation ou AOAC precisa ser verificado?
Sim. O certificado respalda o método, mas a ISO/IEC 17025 exige que cada laboratório verifique que pode aplicá-lo corretamente antes de usá-lo, e a ISO 16140-3 descreve como fazê-lo.
O que é o eLOD50?
É o nível de detecção a 50 % estimado durante a verificação de um método qualitativo: a contaminação na qual o método detecta o microrganismo em metade das porções analisadas. A ISO 16140-3 aceita o resultado se não ultrapassar quatro vezes o LOD50 obtido na validação.
O que acontece com os métodos de referência ISO que não têm dados de validação?
Até 31 de dezembro de 2027 podem ser verificados com o protocolo transitório do anexo F da ISO 16140-3. A partir de 1º de janeiro de 2028, apenas os métodos de referência validados poderão ser verificados segundo essa norma.