Parte do pilar de fundamentos e padronização do Centro de Aprendizagem TAAG. Aprofunda o que vimos sobre como se interpretam as UFC e a etapa de enriquecimento microbiológico.
Índice do artigo
Um resultado microbiológico sempre traz uma margem
Um laudo diz "Salmonella: não detectada em 25 g" ou "aeróbios mesófilos: 1,2 × 105 UFC/g". Os dois resultados parecem definitivos, mas nenhum deles o é por completo. O primeiro depende da probabilidade de o método detectar as poucas células que pudessem existir na porção analisada. O segundo é uma estimativa com uma dispersão que, em microbiologia, é muito maior que em uma análise química. Entender essas margens é o que permite decidir bem quando um resultado fica perto de um limite.
Por que a microbiologia é diferente
As bactérias não se distribuem em um alimento como uma substância dissolvida. São partículas discretas, muitas vezes agrupadas, e quando estão em baixa concentração sua presença em uma porção de ensaio é questão de acaso. Se um lote tem em média uma célula de Salmonella a cada 25 g, algumas porções de 25 g não terão nenhuma, outras terão uma e outras duas ou mais. Essa distribuição aleatória segue uma distribuição de Poisson e fixa um limite teórico que nenhum método pode superar.
O teto teórico de qualquer método
Com uma distribuição de Poisson, a probabilidade de uma porção conter pelo menos uma célula é 1 − e−λ, em que λ é o número médio de células por porção. Com uma média de 1 UFC por porção, essa probabilidade é de cerca de 63 %: mesmo um método perfeito falharia em mais de um terço dos casos, simplesmente porque a célula não está na porção. Para alcançar 50 % de detecção basta uma média de ln 2, cerca de 0,69 UFC por porção; para chegar a 95 % são necessárias cerca de 3 UFC por porção.
Métodos qualitativos: do LOD ao LOD50
Em um método de detecção (presença ou ausência), o limite de detecção não se expressa como um número fixo, mas como uma curva de probabilidade de detecção (POD) em função da contaminação. Wilrich e Wilrich descreveram em 2009, no Journal of AOAC International, um modelo estatístico para estimar essa curva e o LODp, a contaminação que o método detecta com probabilidade p. O valor mais usado é o LOD50: a concentração na qual o método dá positivo em metade das porções analisadas.
O LOD50 permite comparar métodos entre si e com o teto teórico. A ISO 16140-2 o usa para calcular o nível de detecção relativo (RLOD) entre um método alternativo e o de referência, e a ISO 16140-3 pede a cada laboratório que estime seu próprio eLOD50 ao verificar um método e confirme que não ultrapassa quatro vezes o da validação. O procedimento é explicado no artigo sobre validação e verificação de métodos.
O que significa "ausência em 25 g"
Um resultado negativo significa que o método não detectou o microrganismo nessa porção, não que o lote esteja livre dele. Por isso os critérios de ausência são aplicados sobre várias unidades de amostra, e por isso importa tanto a etapa de enriquecimento: é ela que permite que uma única célula, muitas vezes danificada, se multiplique até níveis detectáveis. Quantas unidades analisar e qual probabilidade de detectar um lote contaminado cada plano oferece é desenvolvido no artigo sobre planos de amostragem por atributos.
Métodos quantitativos: o limite de quantificação
Em uma contagem em placa, o limite inferior é fixado pela menor diluição semeada. Se se semeia 1 mL da diluição 10−1 e não cresce nenhuma colônia, o resultado não é "0 UFC/g", mas "menor que 10 UFC/g" (no exemplo do guia da ISO 19036, com duas diluições sem colônias, o limite calculado é de 9,1 UFC/g). Reportar "0" é um dos erros de interpretação que já comentamos no artigo sobre UFC.
Incerteza de medição em contagens: ISO 19036:2019
A ISO/IEC 17025 exige dos laboratórios acreditados que avaliem a incerteza de medição de seus ensaios. Para as contagens de microbiologia de alimentos, a referência é a ISO 19036:2019, publicada em outubro de 2019 como revisão da especificação técnica de 2006. A apresentação do grupo de trabalho da ISO lembra que os resultados quantitativos em microbiologia são muito variáveis, da ordem de 0,1 a 1 log10.
Os três componentes
- Incerteza técnica: a variabilidade das etapas da análise (pesagem, diluições, semeadura, incubação, contagem, confirmação, lotes de meios, analistas). É estimada de preferência como o desvio padrão de reprodutibilidade intralaboratorial (sIR), analisando pelo menos 10 amostras com dois resultados cada uma sob condições que variem tanto quanto na rotina. Costuma ser o maior componente.
- Incerteza de matriz: em que medida a porção de ensaio não representa a amostra de laboratório. Para líquidos ou amostras bem homogeneizadas pode-se usar um valor fixo de 0,1 log10; em alimentos sólidos ou de vários componentes pode ser muito maior.
- Incerteza distribucional: a variação aleatória de Poisson. Calcula-se a partir do total de colônias contadas (0,4343/√ΣC em log10) e pesa sobretudo quando se contam poucas colônias.
Incerteza expandida e como se informa
Os componentes são combinados como raiz quadrada da soma de seus quadrados, e o resultado é multiplicado por um fator de abrangência k = 2, o que corresponde aproximadamente a um nível de confiança de 95 %. A norma também admite uma opção simplificada, usar apenas a reprodutibilidade, advertindo que ela pode subestimar a incerteza em alimentos sólidos ou em níveis baixos.
O exemplo do guia da ISO mostra isso bem: uma contagem de 1,00 × 105 UFC/g, com incerteza expandida de 0,31 log10, é informada como 5,00 ± 0,31 log10 UFC/g. Em valores naturais, o intervalo vai de 4,90 × 104 a 2,04 × 105 UFC/g: mais que o dobro entre um extremo e outro.
O que a incerteza de medição não inclui
A ISO 19036 deixa de fora duas fontes de erro. A primeira é a incerteza de amostragem, o erro de extrair a amostra de laboratório do lote, que pode ser grande mas não é atribuída ao laboratório. A segunda é o viés: em microbiologia de alimentos não existe um valor "verdadeiro" independente do método com o qual comparar um resultado de rotina.
Do número à decisão
Imagine uma contagem de 1,2 × 102 UFC/g frente a um limite de 100 UFC/g. Com uma incerteza expandida típica de várias décimas de log, o valor real poderia estar abaixo do limite. O produto cumpre ou não? A resposta depende da regra de decisão. A ISO/IEC 17025 pede que, quando o laboratório declara conformidade, documente a regra que usa e o risco de aceitar ou rejeitar por engano. Um critério habitual considera não conforme um resultado apenas se ultrapassa o limite em mais que a incerteza expandida; outro, mais conservador, considera conforme apenas o que fica abaixo do limite menos essa incerteza. Escolher entre eles é uma decisão de gestão de risco, não um detalhe do laboratório.
Erros comuns
- Ler "não detectado" como garantia de ausência em todo o lote.
- Comparar métodos apenas pelo tempo de resposta, sem revisar seu LOD50 na matriz de interesse.
- Informar "0 UFC/g" em vez de "< limite de quantificação".
- Tratar diferenças de 0,2 ou 0,3 log entre duas contagens como uma mudança real do processo.
- Pedir a declaração de conformidade sem acordar antes a regra de decisão.
Conclusão
Em microbiologia, um resultado nunca vem sozinho: traz uma probabilidade de detecção se é qualitativo e uma incerteza se é quantitativo. O LOD50 permite comparar métodos e entender o que realmente significa um negativo; a ISO 19036 permite colocar um intervalo em cada contagem. Usar essas margens, junto com uma regra de decisão acordada, é o que evita liberar ou rejeitar um lote por uma diferença que o próprio método não consegue distinguir.
Sobre a TAAG
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Perguntas frequentes
O que é o LOD50 de um método microbiológico?
É a concentração do microrganismo na qual um método de detecção dá positivo em 50 % das porções analisadas. É usado porque em microbiologia a detecção é probabilística: mesmo um método perfeito só alcança 50 % de detecção com cerca de 0,69 UFC em média por porção, devido à distribuição aleatória das células.
Por que um resultado "não detectado" não significa zero?
Porque o método analisa apenas uma porção da amostra e tem um limite de detecção. Se o microrganismo está em baixa concentração ou distribuído de forma irregular, pode não estar na porção analisada ou não alcançar níveis detectáveis.
Que norma se usa para estimar a incerteza de uma contagem microbiológica?
A ISO 19036:2019. Combina a incerteza técnica, a de matriz e a distribucional, e expressa o resultado como incerteza expandida com fator de abrangência k = 2, aproximadamente 95 % de confiança.
A incerteza de medição inclui o erro de amostragem do lote?
Não. A ISO 19036 exclui expressamente a incerteza de amostragem, ou seja, o erro de extrair a amostra do lote. Esse risco é gerenciado com o desenho do plano de amostragem.