Parte do pilar de métodos de laboratório do Centro de Aprendizagem TAAG, junto com enriquecimento microbiológico.
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Um positivo nem sempre é um resultado final
Em um laudo de laboratório, "positivo" pode significar duas coisas distintas. Pode ser um resultado presuntivo: o teste deu um sinal compatível com o microrganismo procurado, mas sua identidade ainda não foi demonstrada. Ou pode ser um resultado confirmado: o microrganismo foi isolado e comprovou-se, com testes adicionais, que é realmente o alvo da análise. Confundir ambos leva a decisões precipitadas em um sentido ou no outro: liberar produto que devia ser retido ou destruir um lote por um resultado que não se sustentava.
Este artigo percorre esse trecho da análise, da triagem à confirmação, tomando como referência o Manual Analítico Bacteriológico (BAM) da FDA para Salmonella e a série de normas ISO 16140, que define como se validam os métodos alternativos frente aos de referência.
De onde vem um resultado presuntivo
No cultivo tradicional
No cultivo microbiológico tradicional, uma colônia com a morfologia típica em um meio seletivo é um achado presuntivo. O capítulo 5 do BAM descreve a sequência para Salmonella: preparo e pré-enriquecimento no primeiro dia, enriquecimento seletivo no segundo, semeadura em placas seletivas no terceiro, triagem bioquímica no quarto e confirmação no quinto. O próprio manual indica que o método de cultivo leva de 4 a 5 dias para chegar a um resultado presuntivo.
Nos métodos moleculares de triagem
A PCR e outros métodos rápidos costumam ser usados como triagem. A edição do BAM de janeiro de 2026 inclui uma seção, adicionada em maio de 2024, com métodos de qPCR e LAMP desenvolvidos pela FDA que se aplicam à cultura de pré-enriquecimento de 24 horas, ou seja, o segundo dia. A regra fixada pelo manual é clara: as amostras com triagem negativa são informadas como negativas e não requerem mais análise de cultivo; as amostras com triagem positiva devem ser confirmadas por cultivo seguindo os procedimentos de isolamento e identificação.
Essa assimetria explica o valor da triagem. A maioria das amostras de rotina é negativa, e para elas o resultado chega dias antes. Apenas as positivas percorrem o caminho longo.
O que diz a ISO 16140-2 sobre a confirmação
A ISO 16140-2:2016 é o protocolo de validação de métodos alternativos (em geral comerciais) frente a um método de referência. A norma parte de uma ideia útil para o trabalho diário: muitos métodos alternativos têm duas etapas, primeiro o enriquecimento e a detecção, e depois a confirmação desse resultado. O resultado final do método é o que sai da segunda etapa.
Durante a validação, a norma exige confirmar os positivos do método alternativo que não coincidem com o método de referência, porque essa confirmação é a que permite saber se se trata de um verdadeiro ou de um falso positivo. A confirmação deve ser capaz de recuperar o isolado e demonstrar sua identidade, e pode se basear no procedimento do método de referência, na etapa de confirmação do próprio método alternativo, em uma combinação de ambos ou em qualquer outro meio que consiga isolar e identificar o microrganismo.
Há um detalhe técnico com consequências práticas. Se o enriquecimento do método alternativo é diferente do de referência (menos etapas ou menos horas de incubação), a norma pede uma segunda via de confirmação: derivar parte do enriquecimento do método alternativo para o esquema do método de referência, respeitando pelo menos seu tempo total de incubação. Em outras palavras, um enriquecimento curto pode bastar para detectar um sinal molecular, mas não necessariamente para recuperar uma colônia em placa.
Esta norma tem peso regulatório. Na União Europeia, o Regulamento (UE) 2019/229 modificou o artigo 5 do Regulamento (CE) 2073/2005 para exigir que os métodos alternativos estejam validados frente ao método de referência do anexo I conforme a EN ISO 16140-2, e que os métodos registrados sejam certificados por um organismo independente. Na prática, a validação e a certificação AOAC-PTM ou ISO 16140 de um método incluem seu protocolo de confirmação.
Como se confirma hoje
Bioquímica e sorologia
A via clássica combina testes bioquímicos, que avaliam quais substratos o isolado metaboliza, com sorologia, que identifica antígenos de superfície. Para Salmonella, o BAM pede que a confirmação sorológica, com os antígenos somáticos (O) e flagelares (H), seja sempre acompanhada de confirmação bioquímica. Permite substituir a bateria de tubos convencional por sistemas como API 20E, Enterotube II ou Vitek 2 GN, mas adverte que os kits bioquímicos comerciais não substituem a sorologia.
Métodos instrumentais e moleculares sobre o isolado
O BAM também aceita como confirmação de isolados presuntivos uma qPCR e um LAMP desenvolvidos pela FDA, um método de amplificação isotérmica (AOAC OMA 2013.14) e a identificação por espectrometria de massas MALDI-TOF (AOAC OMA 2017.09), além de outros métodos validados segundo as diretrizes da FDA, o Apêndice J da AOAC ou a ISO 16140-6:2019. Um isolado é informado como Salmonella se a sorologia e a bioquímica o confirmam em conjunto, ou um dos métodos instrumentais aceitos. Se as confirmações se contradizem, recorre-se a testes adicionais ou a um laboratório de referência para a tipificação definitiva.
ISO 16140-6: validar o próprio método de confirmação
A ISO 16140-6:2019 cobre a validação de métodos alternativos de confirmação e de tipificação. Compara o método alternativo com o procedimento de confirmação do método de referência ou, quando necessário, com um método de confirmação de referência como o sequenciamento genômico completo (WGS). Aplica-se também à tipificação, por exemplo a sorotipagem de Salmonella ou a tipificação molecular de STEC.
Por que um presuntivo pode não se confirmar
Um positivo de triagem que não se confirma não significa automaticamente que o teste "errou". As causas possíveis são várias e convém distingui-las:
- Material genético sem célula viável: um método baseado em DNA pode detectar restos de células inativadas por um tratamento térmico ou um sanitizante, um limite que explicamos em RNA vs. DNA. Nesse caso não há nada vivo para isolar.
- Reatividade cruzada: um organismo não alvo que compartilha parte da sequência procurada. É o que avalia o estudo de exclusividade durante a validação do método.
- Dificuldade para recuperar o isolado: células estressadas, uma microbiota acompanhante que compete no enriquecimento ou níveis muito baixos podem impedir a obtenção da colônia mesmo que o patógeno estivesse presente. Por isso a ISO 16140-2 contempla a segunda via de confirmação quando os enriquecimentos diferem.
- Contaminação no laboratório: um arraste de material amplificado ou de um controle positivo. Os controles de cada corrida, que desenvolvemos em controles de uma PCR, existem para detectá-lo.
O que fazer enquanto a confirmação não chega
A confirmação é uma etapa analítica, mas a decisão sobre o produto é tomada pela planta. Alguns critérios razoáveis:
- Produto acabado: um lote com resultado presuntivo positivo é retido até a confirmação. Liberar um lote "porque ainda não está confirmado" inverte a lógica da triagem.
- Ambiente: em um programa de monitoramento ambiental, muitas plantas tratam o presuntivo como um sinal para agir de imediato (limpeza reforçada, amostragem de vetores ao redor do ponto positivo) sem esperar a confirmação, porque o custo de reagir tarde é maior.
- Rastreabilidade do isolado: se o resultado se confirma, conservar o isolado permite tipificá-lo depois e compará-lo com achados anteriores da mesma planta.
O que não convém é informar como definitivo um presuntivo, nem descartar um presuntivo não confirmado sem entender por que não se confirmou. Ambas são decisões de laboratório que devem estar escritas no procedimento antes que chegue o primeiro positivo.
Conclusão
Um resultado presuntivo é um sinal que ainda não demonstrou a identidade do microrganismo, e um confirmado é um isolado identificado com testes adicionais. O BAM da FDA exige confirmar por cultivo os positivos de triagem, a ISO 16140-2 integra a confirmação à validação dos métodos alternativos e a ISO 16140-6 permite validar métodos mais rápidos para essa etapa. Entre ambos os momentos, a planta decide: reter o produto, agir sobre o ambiente e deixar escrito o que se faz quando um presuntivo não se confirma.
Sobre a TAAG
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Perguntas frequentes
Um positivo por PCR é um resultado definitivo?
Na maioria dos esquemas, não. O BAM da FDA estabelece que as amostras com triagem positiva por qPCR ou LAMP devem ser confirmadas por cultivo, enquanto as negativas são informadas como negativas sem mais análise.
Quanto tempo leva a confirmação de Salmonella por cultivo?
O BAM descreve um fluxo de cinco dias: pré-enriquecimento, enriquecimento seletivo, semeadura em placas, triagem bioquímica e confirmação. O próprio manual indica que o método de cultivo leva de 4 a 5 dias para chegar a um resultado presuntivo.
Pode-se confirmar com MALDI-TOF ou PCR em vez de sorologia?
Sim, sobre o isolado. O BAM aceita, entre outros, uma qPCR e um LAMP da FDA e a identificação por MALDI-TOF (AOAC OMA 2017.09). A ISO 16140-6:2019 define como validar esses métodos alternativos de confirmação.
O que significa um presuntivo não se confirmar?
Pode tratar-se de um falso positivo, mas também de DNA de células não viáveis, de um isolado difícil de recuperar ou de uma contaminação no laboratório. Por isso convém investigar a causa antes de descartar o resultado.