Este artigo acompanha a amostra depois de transporte e conservação de amostras e completa os planos de amostragem por atributos com o que acontece dentro do laboratório.
Índice do artigo
A etapa que ninguém vê no laudo
Um resultado microbiológico é relatado como "ausência em 25 g" ou "3.200 UFC/g", mas entre o saco que chega ao laboratório e a placa ou o caldo há uma etapa que quase nunca aparece no laudo: o preparo da amostra. Quanto se pesa, em que diluente, quanto se homogeneíza, quanto tempo a suspensão espera e se porções são reunidas: cada decisão muda o que o número significa. A coleta de amostras na planta está em amostragem de superfícies e o envio até o laboratório em transporte e conservação de amostras; este artigo começa onde esses terminam, com a amostra já recebida.
A referência internacional para essa etapa é a série ISO 6887, do comitê ISO/TC 34/SC 9. Ela tem seis partes: a 6887-1:2017 fixa as regras gerais e as outras cinco se aplicam a grupos de produtos: carnes (6887-2:2017), pescados e produtos da pesca (6887-3:2017), produtos diversos como ovos, vegetais, cacau, ervas e especiarias (6887-4:2017), leite e produtos lácteos (6887-5:2020) e amostras da produção primária, da granja ao abatedouro (6887-6:2013). Se o método específico de um microrganismo traz instruções próprias, estas têm prioridade.
A suspensão inicial 1:10, passo a passo
Pesagem e proporção
A ISO 6887-1 pede pesar ou medir a porção analítica com uma tolerância de ±5 %, com um mínimo de 10 g ou 10 mL salvo indicação contrária do método, e adicionar 9 vezes essa quantidade de diluente, medido preferencialmente por massa com uma tolerância de ±2 %. Assim se obtém a diluição 1:10. A norma admite outras proporções quando necessário: 1 em 20, 1 em 50 ou 1 em 100 para produtos que dão suspensões espessas demais, e 1 em 2 ou 1 em 5 quando se buscam contagens baixas, embora advirta que estas últimas podem desequilibrar a relação entre inóculo e meio e devem ser verificadas caso a caso. Qualquer proporção não padrão é levada ao cálculo final.
Diluentes
Para uso geral a norma define dois diluentes: a solução salina peptonada (1 g de digerido enzimático de caseína e 8,5 g de cloreto de sódio por litro) e a água peptonada tamponada, ambos com pH final de 7,0 ± 0,2 a 25 °C. Existe além disso uma versão de dupla concentração da água peptonada tamponada para produtos muito ácidos. O volume final não pode se desviar mais de ±2 % e os diluentes devem passar em uma prova de desempenho: após 45 minutos a 1 hora em temperatura ambiente, a contagem da cepa de controle deve ficar dentro de ±30 % da inicial. Os requisitos de desempenho de diluentes e meios são detalhados na ISO 11133.
Homogeneização
A mistura é homogeneizada segundo a ISO 7218 (quarta edição, de 2024), com um homogeneizador rotativo (liquidificador de laboratório) ou um peristáltico, o equipamento de pás que golpeia um saco estéril e que nos laboratórios costuma ser chamado de stomacher. Se necessário, as partículas grandes são deixadas sedimentar por até 15 minutos; os sacos com filtro integrado são uma alternativa equivalente. Para produtos duros ou secos, a norma limita o homogeneizador rotativo a 2,5 minutos seguidos e a picagem ou moagem prévia a 1 minuto, para evitar que a amostra aqueça. O manual da FDA para alimentos (BAM, capítulo 1) usa para as contagens 50 g de amostra em 450 mL de diluente fosfato de Butterfield, liquidificados durante 2 minutos.
Tempos máximos
A ISO 6887-1 estabelece que entre o fim do preparo da suspensão inicial e o contato do inóculo com o meio de cultura final não podem passar mais de 45 minutos, e que entre a suspensão inicial e o início das diluições não podem passar mais de 30 minutos. Se o laboratório estiver acima de 27 °C, ambos os tempos deveriam ser reduzidos. O BAM é mais rigoroso: no máximo 15 minutos desde a homogeneização até que todas as diluições estejam em seus meios. Em uma suspensão rica em nutrientes os microrganismos podem começar a se multiplicar e o resultado sai mais alto que o da amostra real.
Diluições decimais
Para cada passo decimal transfere-se 1 mL ± 0,02 mL para um tubo com 9 mL ± 0,2 mL de diluente, sem introduzir a pipeta mais de 1 cm, misturando de 5 a 10 segundos e com uma ponteira nova em cada passo.
Regras por tipo de alimento
Congelados
Para embalagens pequenas (em geral menos de 2 kg), a ISO 6887-1 permite levá-las a uma consistência que permita retirar a porção, a 18-27 °C por no máximo 3 horas ou a 5 ± 3 °C por no máximo 24 horas, e desaconselha descongelar em banho de água ou sob água corrente, pelo risco de contaminação se a embalagem não for hermética. O BAM prefere não descongelar e, se necessário, o faz a 2-5 °C em no máximo 18 horas, ou abaixo de 45 °C durante no máximo 15 minutos com agitação em banho termostatizado.
Carnes
A ISO 6887-2 cobre carnes frescas, refrigeradas, congeladas, curadas, fermentadas, picadas, preparados de carne, carne separada mecanicamente, carnes cozidas, secas e defumadas, extratos concentrados e amostras de carcaça coletadas por excisão ou swab. Distingue, entre outros casos, blocos e cortes, embutidos com tripa e amostras de superfície ou de profundidade. A coleta de amostras na carcaça é matéria da ISO 17604. O contexto da indústria está em microbiologia na indústria de carnes.
Laticínios
A ISO 6887-5 tem procedimentos próprios para leite líquido, leite e soro em pó, queijos, caseínas e caseinatos (com um caso especial para a caseína coalho), manteiga, sorvetes, sobremesas lácteas de pH superior a 5, leites fermentados e iogurtes de pH inferior a 5 e fórmulas infantis em pó. O BAM ilustra por que não se pode tratar tudo da mesma forma: para Salmonella em queijo, liquidifica 25 g com 225 mL de caldo lactosado durante 2 minutos, deixa repousar 60 minutos e ajusta o pH a 6,8 ± 0,2; o leite em pó desnatado instantâneo, por outro lado, é despejado suavemente sobre a superfície do caldo e incubado sem misturar.
Pescados e frutos do mar
A ISO 6887-3 abrange pescado inteiro ou em filés, crustáceos, cefalópodes, moluscos bivalves, gastrópodes, tunicados e equinodermos, além de defumados, cozidos e blocos congelados, e inclui procedimentos especiais para moluscos, tunicados e equinodermos crus de zonas de produção primária.
Alimentos secos, ácidos e gordurosos
- Baixa umidade: pesar primeiro o diluente e depois adicionar a porção, para reduzir o choque osmótico, e deixar de molho por até 1 hora se o produto for duro. O BAM, para pós, adiciona primeiro cerca de 15 mL de caldo, forma uma suspensão sem grumos e completa o volume em porções.
- Ácidos: a suspensão deve voltar a pH 7,0 ± 0,5. A água peptonada tamponada basta para produtos de pH 4,5 ou mais; entre pH 3,5 e 4,5 pode-se usar a de dupla concentração, verificando o pH na primeira vez.
- Gordurosos (mais de 20 %): pode-se adicionar polissorbato 80 ao diluente, entre 1 e 10 g/L; em geral basta 1 g/L para cada 10 % de gordura.
- Especiarias inibitórias: o BAM adiciona sulfito de potássio a 0,5 % para cebola e alho desidratados, e dilui pimenta-da-jamaica, canela e orégano a 1:100 e o cravo-da-índia a 1:1000, porque não se conhece uma forma de neutralizar seu efeito.
Compostas e agrupadas: não é a mesma coisa
Reunir unidades de um mesmo lote economiza trabalho e reagentes. A emenda 1 de 2024 à ISO 6887-1 precisa dois conceitos que na prática se confundem:
- Amostra composta: misturam-se várias unidades e da mistura retira-se uma porção do tamanho indicado pelo método, por exemplo 25 g. O resultado continua sendo expresso em 25 g.
- Amostra agrupada (pooling): reúnem-se várias unidades ou porções e analisa-se a mistura completa. O resultado é expresso na massa total, por exemplo 100 g ou 375 g.
Pode-se agrupar fora do laboratório, unindo amostras individuais em uma maior, ou dentro dele, unindo porções em um único pré-enriquecimento grande ou unindo caldos já pré-enriquecidos. Há regras firmes: apenas para ensaios qualitativos, apenas com unidades da mesma origem (mesmo lote ou partida) e sem combinar duas modalidades ao mesmo tempo, por exemplo agrupar porções e depois agrupar também seus caldos.
25 g ou 375 g: o que muda ao aumentar a porção
O esquema clássico vem do BAM: de cada unidade de amostra retira-se uma porção de 25 g e até 15 porções podem ser reunidas em uma composta de 375 g, que é analisada inteira mantendo a proporção 1:9 (375 g em 3.375 mL de caldo). O número de unidades depende da categoria do alimento: 60 para a categoria I (sem etapa letal e destinado a idosos, doentes ou lactentes), 30 para a II e 15 para a III, ou seja, 4, 2 ou 1 composta de 375 g. Um único positivo rejeita o lote. O BAM exclui da composição, entre outros, o leite em pó não instantâneo e o leite integral em pó.
A emenda de 2024 impõe condições técnicas para que o volume grande não esconda um positivo:
- O caldo de pré-enriquecimento deve estar pré-aquecido à temperatura de incubação.
- É preciso conhecer o perfil de temperatura do volume grande. Tomando o exemplo da ISO 6579-1, cujo pré-enriquecimento dura entre 16 e 20 horas, a mistura deve se manter entre 34 °C e 38 °C durante pelo menos 16 horas, e o tempo até atingir essa temperatura deve ser minimizado.
- A proporção amostra/diluente do método validado não é alterada, salvo para aumentá-la em matrizes inibitórias como cebola em pó, alho, orégano, pimentões, alguns chás e cafés, pré-misturas vitamínicas ou produtos muito salgados.
- Uma amostra de laboratório maior que o máximo é dividida: 750 g são processados como duas porções de 375 g.
Além disso, o tamanho maior precisa estar validado. Se foi validado em um estudo segundo a ISO 16140-2 ou a ISO 16140-5, cada laboratório só precisa verificá-lo segundo a ISO 16140-3 dentro da mesma categoria de alimento; caso contrário, deve validá-lo por conta própria com o protocolo do anexo H da emenda 1:2024 da ISO 16140-4, demonstrando com o nível relativo de detecção (RLOD) que o LOD50 não piora. Uma vez validados 375 g, podem ser usadas porções menores na mesma proporção. Esses conceitos são explicados em validação e verificação de métodos.
A evidência respalda a abordagem quando bem executada. Tomás Fornés e colaboradores validaram o agrupamento de porções até 375 g para Salmonella com cinco métodos (cultura, ELISA e PCR em tempo real) em 23 alimentos (confeitaria, fórmula infantil, alimento para animais de estimação, bebidas em pó, entre outros). Em 22 dos 23 o RLOD50 frente a 25 g foi aceitável (menor que 2,5), com a condição de pré-aquecer o caldo e respeitar o tempo máximo de incubação. O agrupamento também aparece na regulamentação: o Regulamento (CE) 2073/2005 pede unir a pele do pescoço de pelo menos três carcaças de aves do mesmo lote de origem em uma amostra de 26 g, e agrupar os swabs de diferentes pontos de uma carcaça antes da análise. Como se leem n e c nesses planos está em planos de amostragem por atributos, e por que a etapa do caldo é decisiva, em enriquecimento microbiológico.
Quais kits e meios da TAAG se relacionam
O kit define para qual porção está validado. No catálogo da TAAG, o Elevia 1.1 Salmonella spp. (V-PAT04, RT-qPCR com tecnologia AiGOR) declara uma sensibilidade de 1 UFC/375 g em alimentos e 1 UFC/amostra em superfícies; sua certificação AOAC cobre porções de 375 g de chocolate 62 % cacau, licor de cacau, leite em pó desnatado e amendoim, e a TAAG declara também matrizes validadas como chocolates recheados, carne bovina moída (90 % magra), pellets de ração animal, ovos líquidos pasteurizados e superfícies de aço inoxidável. Sua ficha técnica lista o suplemento Potentia 1 Salmonella spp. (V-PET06), um potencializador de crescimento para a água peptonada tamponada. O Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97, PCR em tempo real) declara 1 UFC/25 g, com matrizes validadas de coxa de frango crua, hambúrguer de carne congelado, linguiça tipo longaniza, mortadela e superfícies, e está associado ao Augmentis 14 Universal Gram negative (V-FL46, frascos de 225 mL, o volume de caldo para 25 g a 1:10). Usar um kit com uma porção, uma matriz ou um esquema de agrupamento diferentes dos declarados exige a verificação ou validação que a emenda da ISO 6887-1 pede. Para escolher segundo a matriz, ver como escolher um kit da TAAG.
Conclusão
O preparo da amostra decide o que um resultado representa tanto quanto o método de detecção. A ISO 6887-1 fixa a suspensão inicial 1:10, diluentes controlados, homogeneização sem aquecer a amostra e um máximo de 45 minutos até a semeadura, e as partes 2 a 6 ajustam essas regras a carnes, pescados, laticínios, produtos secos e produção primária. Compor ou agrupar porções para patógenos é uma ferramenta válida e respaldada por evidência, mas apenas com unidades do mesmo lote, caldo pré-aquecido, proporção constante e um tamanho de porção validado. Deixar essas decisões por escrito no procedimento do laboratório é o que permite comparar resultados entre turnos, analistas e laboratórios.
Sobre a TAAG
Consulte a TAAG se o Elevia 1.1 Salmonella spp. ou o Ampliora 1.1 Salmonella spp. estão validados para a porção analítica e o esquema de pooling que seu laboratório usa.
Perguntas frequentes
Por que a suspensão inicial é preparada a 1:10?
Porque a ISO 6887-1 define a diluição primária como a porção analítica misturada com, normalmente, nove vezes sua quantidade de diluente, o que dá a base de uma série decimal. A norma admite outras proporções, como 1 em 20 ou 1 em 100 para produtos espessos, desde que sejam consideradas no cálculo do resultado.
Quanto tempo uma suspensão pode esperar antes de ser semeada?
Segundo a ISO 6887-1, no máximo 45 minutos desde o fim da suspensão inicial até que o inóculo toque o meio final, e no máximo 30 minutos até começar as diluições. Se o laboratório ultrapassar 27 °C, esses tempos deveriam ser reduzidos. O BAM da FDA fixa um máximo de 15 minutos desde a homogeneização até ter todas as diluições em seus meios.
Qual a diferença entre uma amostra composta e uma agrupada?
Na composta misturam-se várias unidades e analisa-se uma porção do tamanho do método, por exemplo 25 g, e o resultado é expresso em 25 g. Na agrupada analisa-se a mistura completa, por exemplo 375 g, e o resultado é expresso nessa massa total. Ambas são apenas para ensaios qualitativos e com unidades do mesmo lote.
É possível analisar 375 g em vez de 25 g para Salmonella?
Sim, se o método estiver validado para essa porção maior e forem respeitadas as condições da emenda 1:2024 da ISO 6887-1: caldo pré-aquecido, perfil de temperatura conhecido e a mesma proporção amostra/diluente. Se o tamanho não foi validado segundo a ISO 16140-2 ou 16140-5, o laboratório deve validá-lo com o protocolo do anexo H da emenda da ISO 16140-4.
Como descongelar uma amostra antes da análise?
A ISO 6887-1 permite deixar as embalagens pequenas a 18-27 °C por até 3 horas ou a 5 ± 3 °C por até 24 horas, e desaconselha o banho de água ou a água fria corrente. O BAM prefere não descongelar e, se necessário, usa 2-5 °C em no máximo 18 horas ou menos de 45 °C durante no máximo 15 minutos com agitação.