Este artigo aprofunda um dos requisitos explicados em acreditação ISO/IEC 17025 em laboratórios de alimentos e complementa validação e verificação de métodos microbiológicos.
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O que é um ensaio de proficiência e como se diferencia de outras comparações
Um laboratório com métodos validados e analistas capacitados pode carregar um viés que ninguém detecta de dentro. A forma de enxergá-lo é comparar seus resultados com os de outros laboratórios que analisam o mesmo material. A ISO/IEC 17043:2023 define a comparação interlaboratorial como a organização, realização e avaliação de medições ou ensaios sobre itens iguais ou similares por dois ou mais laboratórios, de acordo com condições predeterminadas. O ensaio de proficiência (em inglês, proficiency testing ou PT) é um caso particular: avalia o desempenho de cada participante frente a critérios fixados previamente, por meio de uma comparação interlaboratorial.
Nem toda comparação avalia o laboratório. Um estudo interlaboratorial para obter as características de desempenho de um método, como os da série ISO 16140 descrita em validação e verificação de métodos microbiológicos, mede o método e não o participante.
O que a ISO/IEC 17025 exige
A cláusula 7.7 da ISO/IEC 17025:2017 pede um procedimento para assegurar a validade dos resultados. O item 7.7.1 reúne as medidas internas (materiais de referência, controles, repetições, comparação entre analistas) e o 7.7.2 acrescenta o olhar externo: o laboratório deve monitorar seu desempenho comparando-o com os resultados de outros laboratórios, por meio de ensaios de proficiência ou outras comparações interlaboratoriais, quando disponíveis e apropriados. O marco geral da acreditação está em acreditação ISO/IEC 17025 em laboratórios de alimentos.
A política ILAC-P9:01/2024, aplicada pelos organismos de acreditação signatários do acordo de reconhecimento mútuo da ILAC, traduz esse requisito em regras concretas:
- A participação é considerada obrigatória quando o ensaio de proficiência está disponível, é apropriado e é julgado necessário segundo a análise de riscos do laboratório.
- O laboratório deve ter um plano de participação, e o organismo de acreditação o avalia antes de conceder a acreditação para verificar se cobre o escopo de forma representativa.
- Quando o desempenho não é satisfatório, o organismo avalia a evidência de ações corretivas rápidas e adequadas.
Nível e frequência de participação
Ninguém participa de um ensaio para cada combinação de método, analito e matriz. A ILAC-P9, seguindo o guia EA-4/18 G:2021, propõe agrupar o escopo em áreas de competência técnica: combinações de técnica, característica e produto suficientemente equivalentes para que o resultado de uma represente as demais. Técnicas diferentes raramente cabem em uma mesma área; produtos diferentes sim, se as matrizes forem de natureza equivalente. A frequência mínima por área é fixada pelo laboratório segundo o risco: volume de análises, rotatividade e experiência do pessoal, estabilidade do analito e da matriz, robustez do método e uso final do dado. O guia cita a segurança dos alimentos entre as áreas que exigem um alto nível de garantia.
As três normas que sustentam um ensaio de proficiência em microbiologia
ISO/IEC 17043:2023: a competência do provedor
Fixa os requisitos de competência e imparcialidade dos provedores de ensaios de proficiência. A segunda edição, de maio de 2023, substituiu a de 2010, que segundo a ILAC-P9 continuava válida até maio de 2026. Para o participante, a pergunta prática é se o provedor está acreditado segundo essa norma por um organismo signatário do acordo da ILAC, que é a forma reconhecida de demonstrar sua competência.
ISO 13528:2022: a estatística
Descreve os métodos estatísticos para desenhar os programas e analisar seus dados, e dá recomendações para interpretar os resultados, tanto quantitativos quanto qualitativos. A terceira edição é de agosto de 2022 e tem uma emenda publicada em 2026. Aqui estão os métodos para fixar o valor designado (o valor de referência da rodada), o desvio-padrão para avaliação de proficiência (σpt, que define quanto se tolera) e os escores de desempenho.
ISO 22117:2019: o específico da microbiologia
Substituiu a especificação técnica ISO/TS 22117:2010 e foi confirmada em sua revisão periódica. Estabelece requisitos e orientações para organizar programas de ensaios de proficiência em microbiologia de alimentos e bebidas, alimentação animal, amostras ambientais da produção e manipulação de alimentos e rações, e produção primária; também da água usada na produção de alimentos ou considerada alimento pela legislação nacional. Cobre a organização técnica do programa e o tratamento estatístico dos resultados, e foi pensada para ser usada junto com a ISO/IEC 17043 e a ISO 13528: só acrescenta o que a microbiologia precisa de forma adicional. Um exemplo é o preparo do material: um programa de 2021 na Índia para Listeria monocytogenes e Salmonella em camarão liofilizado comprovou a homogeneidade e a estabilidade do item durante o armazenamento (até 28 dias) e o transporte (até 6 dias) antes de enviá-lo.
Como ler um z-score
O escore mais usado é o z-score: z = (xi − xpt) / σpt, em que xi é o resultado do laboratório, xpt o valor designado e σpt o desvio para a avaliação. A interpretação habitual, tirada da ISO 13528 e incorporada pelo guia da Eurachem de 2021, é:
- |z| ≤ 2,0: desempenho satisfatório, sem sinal.
- 2,0 < |z| < 3,0: desempenho questionável, sinal de alerta.
- |z| ≥ 3,0: desempenho insatisfatório, sinal de ação.
Um exemplo ilustrativo: se o valor designado de uma contagem é 4,20 log UFC/g, σpt é 0,25 log e o laboratório relata 4,85 log UFC/g, z = 0,65 / 0,25 = 2,6: questionável. O que uma UFC representa e como uma contagem é interpretada é explicado em o que são as UFC.
Duas advertências. Primeiro, o z-score depende do σpt: quanto maior ele é, menor é z e melhor parece o desempenho, então convém verificar se esse valor faz sentido para o uso que o laboratório dá a seus resultados. Segundo, o z-score não considera a incerteza do valor designado. Se essa incerteza-padrão for menor que 0,3·σpt, é considerada desprezível; caso contrário, o provedor deve usar outra forma de fixar o valor designado, escores que a incorporem, como z′ ou zeta (ζ), ou informar os participantes. A relação entre esses escores e a incerteza do próprio laboratório é tratada em limite de detecção e incerteza de medição.
Ensaios qualitativos: quando o resultado é detectado ou não detectado
A maior parte das análises de patógenos é de presença ou ausência, e aí não faz sentido calcular médias nem desvios. A ISO 13528 prevê fixar o valor designado pelo preparo conhecido do item, por materiais de referência ou por julgamento de especialistas, e o desempenho é avaliado com critérios de acertos sobre amostras positivas e negativas. O ensaio de 2024 do laboratório de referência da UE para Salmonella, cujo desenho geral se baseia na ISO 22117, mostra como isso é feito:
- Participaram 68 laboratórios nacionais de referência, que analisaram com a EN ISO 6579-1 swabs de tecido contaminados com S. Typhimurium em diferentes níveis e amostras não contaminadas.
- O critério de bom desempenho exigia pelo menos 2 de 3 positivos no nível alto (37,5 UFC por amostra), pelo menos 2 de 4 no nível baixo (4,5 UFC por amostra) e 0 de 3 positivos nas negativas.
- Sessenta e cinco laboratórios cumpriram. Um falhou no nível baixo, mas demonstrou sua capacidade com amostras de nível extrabaixo e sua classificação passou a desempenho moderado. Outros dois não foram avaliados porque o pacote levou 25 dias para chegar e não era possível garantir a sobrevivência da bactéria.
Esse último ponto ensina algo: um resultado ruim pode se dever ao item e não ao laboratório. Nas duas rodadas da Índia mencionadas, cerca de 16 % dos laboratórios de cada rodada tiveram resultados insatisfatórios, quase todos por falsos positivos. Os autores apontaram como causas prováveis a reconstituição incorreta da amostra ou o tempo insuficiente entre reconstituição e análise, erros operacionais, contaminação cruzada e falhas na identificação ou confirmação de colônias típicas. Este último ponto se conecta com o que é explicado em resultado presuntivo vs. confirmado. Na França, os laboratórios nacionais de referência organizaram entre 2019 e 2021 um programa comum para os laboratórios oficiais, com uma média de 65 participantes por ano.
O que fazer diante de um resultado questionável ou insatisfatório
O guia da Eurachem é claro quanto ao princípio: todo resultado insatisfatório deve ser investigado e documentado, e a avaliação é registrada mesmo que se decida não tomar ações. Um único resultado ruim não prova que o laboratório seja incompetente, mas um desempenho ruim repetido indica um problema sério, e então o laboratório deveria considerar deixar de oferecer esse ensaio até resolvê-lo. A investigação é conduzida dentro do procedimento de não conformidades do laboratório. Uma ordem prática:
- Revisar o relatório. Confirmar que os resultados publicados são os que foram enviados e entender como o escore foi calculado.
- Descartar erros administrativos. Transcrição, rotulagem, decimais ou unidades. Se eles se repetem, o problema está no sistema de gestão, não na técnica.
- Revisar a parte técnica. Armazenamento e reconstituição do item, dados de controle interno da corrida, equipamentos, reagentes e calibração, condições ambientais e processamento de dados. Em microbiologia, isso inclui o controle de desempenho dos meios descrito em controle de qualidade de meios segundo a ISO 11133 e, se foi usada PCR, os controles explicados em controles de uma PCR.
- Revisar o programa. Diferenças de matriz em relação às amostras de rotina, deterioração do item, níveis fora da faixa do método, valor designado ou σpt inadequados, grupo de comparação mal escolhido ou erros do provedor.
- Fechar o ciclo. Analisar a causa com os dados brutos, a rodada completa, as rodadas anteriores e o controle interno; planejar a ação corretiva, executá-la e registrá-la, e verificar sua eficácia, idealmente com uma nova participação.
Para os resultados questionáveis, a Eurachem sugere definir quando investigá-los: por exemplo, diante de escores questionáveis repetidos ou resultados consecutivos com o mesmo sinal de viés.
Como tirar proveito
O item deve ser tratado como uma amostra de rotina: mesmo método, mesmo fluxo e os analistas que processam as amostras habituais. Convém escolher programas cuja matriz e nível se pareçam com a rotina e informar o método usado; no ensaio europeu de 2024, vinte laboratórios informaram também os resultados de um segundo método.
Que relação os kits da TAAG têm com os ensaios de proficiência
A TAAG não organiza ensaios de proficiência nem produz materiais para eles. Mas um laboratório que usa um kit da TAAG em sua rotina deve cobrir esse método em seu plano de participação. Dois exemplos do catálogo são o Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97, PCR em tempo real com sondas fluorescentes, desenho com Mila), com sensibilidade declarada de 1 UFC/25 g e matrizes validadas de coxa de frango crua, hambúrguer bovino congelado, linguicinha tipo longaniza, mortadela e superfície, e o Specio 2.3 Listeria spp. and L. monocytogenes (V-SF04, PCR em tempo real com curva de melting), com sensibilidade declarada de 1 UFC/25 g em alimentos e matrizes declaradas de alimentos, bebidas e superfícies vivas e inertes. Ambos são qualitativos: um positivo é presuntivo até ser confirmado. O catálogo não registra certificações de terceiros para esses kits, de modo que um bom resultado em um ensaio de proficiência demonstra o desempenho do laboratório com esse método, mas não substitui a validação frente ao método de referência que a série ISO 16140 exige para usá-lo em seu lugar. Se a matriz do programa não estiver entre as declaradas, convém confirmar o escopo com a TAAG antes de participar.
Conclusão
Um ensaio de proficiência é a forma mais direta que um laboratório de microbiologia tem de saber se seus resultados coincidem com os de seus pares. A ISO/IEC 17025 o exige quando disponível e apropriado, a ISO/IEC 17043 assegura que o provedor seja competente, a ISO 13528 define como se pontua e a ISO 22117 acrescenta o que as bactérias vivas exigem: homogeneidade, estabilidade e avaliação de resultados qualitativos. Ler bem um z-score ou um critério de acertos, e entender que um resultado ruim pode vir do laboratório ou do item, é o que transforma a participação em melhoria real. Seu valor está menos em ser aprovado na rodada do que em investigar a fundo cada sinal de alerta e de ação.
Sobre a TAAG
Se seu laboratório usa o Ampliora 1.1 Salmonella spp. ou o Specio 2.3 Listeria spp. and L. monocytogenes, consulte a TAAG sobre o escopo de matrizes antes de incluí-los em seu plano de ensaios de proficiência.
Perguntas frequentes
Qual a diferença entre um ensaio de proficiência e uma comparação interlaboratorial?
A comparação interlaboratorial é qualquer exercício em que dois ou mais laboratórios analisam itens iguais ou similares sob condições predeterminadas. O ensaio de proficiência é a comparação usada para avaliar o desempenho de cada participante frente a critérios fixados previamente, segundo as definições da ISO/IEC 17043:2023. Um estudo interlaboratorial para validar um método, por outro lado, avalia o método e não o laboratório.
É obrigatório participar de ensaios de proficiência para ser acreditado na ISO/IEC 17025?
A cláusula 7.7.2 pede comparar o desempenho com o de outros laboratórios quando houver ensaios de proficiência ou outras comparações disponíveis e apropriadas. A política ILAC-P9:01/2024 considera a participação obrigatória quando está disponível, é apropriada e a análise de riscos a torna necessária, e exige um plano de participação que o organismo de acreditação avalia.
Como se interpreta um z-score?
É calculado subtraindo o valor designado do resultado do laboratório e dividindo pelo desvio-padrão para avaliação de proficiência. Com |z| ≤ 2 o desempenho é satisfatório, entre 2 e 3 é questionável (sinal de alerta) e com |z| ≥ 3 é insatisfatório (sinal de ação). O valor depende muito do desvio escolhido pelo provedor, então convém revisá-lo.
Como se avalia um ensaio de proficiência de detecção de patógenos, em que não há números?
Nos ensaios qualitativos não se calculam médias nem z-scores. O desempenho é julgado pelos acertos em amostras positivas em diferentes níveis e em amostras negativas. No ensaio europeu de Salmonella de 2024, por exemplo, exigiam-se pelo menos 2 de 3 positivos no nível alto, 2 de 4 no nível baixo e nenhum positivo nas negativas.
O que um laboratório deve fazer diante de um resultado insatisfatório?
Investigá-lo e documentá-lo sempre, dentro do procedimento de não conformidades. Primeiro descartam-se erros de transcrição ou de unidades, depois revisam-se o manuseio do item, o controle interno, os meios, equipamentos e reagentes, e por último o próprio programa. A ação corretiva é planejada, executada e registrada, e sua eficácia é verificada, idealmente com uma nova participação.