Parte do pilar de tecnologia TAAG. Complementa Ampliora, Elevia e Specio e como escolher um kit da TAAG.
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Uma ficha técnica é um contrato de escopo
Antes de comprar ou implementar um kit de PCR, o laboratório recebe uma ficha técnica com uma dúzia de campos: formato, conteúdo, canais de fluorescência, tempos, sensibilidade, matrizes, equipamentos compatíveis, conservação e, às vezes, uma certificação. É a descrição das condições em que o fabricante demonstrou que o método funciona. Fora delas, o resultado já não está respaldado pela validação.
Este artigo percorre esses campos com exemplos reais do catálogo da TAAG, aplicáveis à ficha de qualquer fornecedor. As diferenças entre linhas estão em Ampliora, Elevia e Specio e a escolha por indústria em como escolher um kit da TAAG.
Formato e conteúdo: o que vem na caixa
Na ficha do Ampliora 1.1 Salmonella spp. (código V-SF97), o formato declarado é SPID, para 96 reações, e o conteúdo é de 12 tiras de PCR pré-carregadas, um tubo de controle positivo de 100 µL e um tubo de controle negativo de 352 µL. O Specio 4.1 (V-SF95) é apresentado em 480 reações, com 60 tiras pré-carregadas e cinco tubos de cada controle.
Convém revisar duas coisas:
- O que está incluído e o que não está. O que não está na caixa (meio de enriquecimento, kit de extração) faz parte do método da mesma forma. A ficha do Ampliora 1.1 associa como produtos relacionados o meio Augmentis 14 Universal Gram negative, o kit de extração Nucleia 2 Tez-Q Plus e o kit de amostragem Collectio 1 NeutroSampling. Substituí-los muda o protocolo avaliado.
- Os controles. Permitem saber se a corrida foi válida, como se explica em controles de uma PCR.
Química de detecção e canais de fluorescência
Sondas ou fluoróforo intercalante
O campo de química indica como o sinal é gerado. As fichas do Ampliora declaram sondas fluorescentes: um oligonucleotídeo marcado que hibridiza dentro da sequência-alvo e gera sinal à medida que o produto se acumula. Holland e colaboradores descreveram em 1991 esse tipo de detecção específica durante a amplificação. Já as fichas do Specio declaram um fluoróforo intercalante, que se liga a qualquer DNA de fita dupla. Por isso esses kits acrescentam uma análise de curva de melting: segundo Ririe, Rasmussen e Wittwer (1997), a forma e a posição dessa curva dependem do conteúdo de GC, do comprimento e da sequência do produto, e permitem distinguir produtos cujas temperaturas de melting diferem em menos de 2 °C.
O que significam FAM, HEX, ROX ou Cy5
São os nomes dos fluoróforos, e cada um é lido em um canal óptico diferente do termociclador. Um kit com sondas atribui um canal a cada alvo e, quando o inclui, outro a um controle. Alguns exemplos literais do catálogo:
- Ampliora 1.1 Salmonella spp.: FAM e HEX.
- Ampliora 3.5 (Salmonella spp., L. monocytogenes e Listeria spp.): FAM, HEX, ROX e Cy5.
- Ampliora 3.9 (STEC, E. coli O157:H7 e Salmonella spp.): FAM, HEX, ROX, Cy5 e Cy5.5.
- Specio 4.1 (Salmonella spp., L. monocytogenes, E. coli e S. aureus): apenas FAM, porque a diferenciação é feita pela curva de melting e não pela cor.
A pergunta prática é se o seu equipamento lê esses canais. Em um kit de um único alvo com dois canais, como o Ampliora 1.1, a ficha ou a bula devem indicar qual canal corresponde ao microrganismo e qual a um controle.
Termocicladores compatíveis
Este campo diz em quais equipamentos o desempenho foi verificado. Um kit multiplex depende de que o equipamento tenha um canal óptico para cada fluoróforo: o Ampliora 3.9 usa cinco, de modo que o termociclador deve ler os cinco, e sua ficha declara o Bio-Rad CFX96.
O catálogo da TAAG tem um caso que mostra por que este campo importa. O Ampliora 3.5 (V-SF59) declara Agilent AriaMx e Bio-Rad CFX96, além de Open qPCR, com FAM, HEX, ROX e Cy5. O Ampliora 3.5R (V-SF74) busca os mesmos três microrganismos, mas declara o QuantStudio 5 Real-Time PCR System e usa FAM, VIC, ROX, TAMRA e Cy5, com um tempo de PCR de 110 minutos em vez de 100. É o mesmo painel adaptado a outra plataforma: não são intercambiáveis.
Se o termociclador do laboratório não consta na ficha, esse uso não está validado e é preciso pedir a evidência ao fabricante.
Tempo de PCR e tempo de incubação: não são a mesma coisa
O tempo de PCR é o que menos diz sobre quando o resultado chega. Na ficha do Ampliora 1.1 consta um tempo de PCR de 100 minutos e, no campo de incubação, um traço. Não é que não haja enriquecimento: o kit de PCR não o inclui. O enriquecimento está na ficha do meio associado, Augmentis 14 Universal Gram negative, que declara 24 ± 2 horas de incubação. O meio Augmentis 91 BPW, associado ao Ampliora 3.9, declara 24 ± 2 horas em geral e pelo menos 8 horas para amostras de cacau.
Para estimar o tempo até o resultado é preciso somar pelo menos três fichas: a do meio, a do kit de extração e a do kit de PCR, mais o tempo de manipulação. Os tempos de PCR do catálogo vão de 80 minutos (Ampliora 4.7 Low-pH Microorganisms) a 120 minutos (os kits Specio, por exemplo); o Elevia 1.1, sobre RNA, declara 95 minutos, o mesmo que o Ampliora 2.3.
Sensibilidade: o que significa "1 UFC/25 g"
A sensibilidade de um kit qualitativo quase sempre é expressa em relação a uma porção analítica: Ampliora 1.1, Ampliora 3.5 e Specio 4.1 declaram 1 UFC/25 g em alimentos; o Ampliora 3.9 e o Elevia 1.1, 1 UFC/375 g. Para superfícies, as fichas do Ampliora 1.1, Ampliora 3.5, Specio 4.1 e Elevia 1.1 expressam a sensibilidade por amostra: 1 UFC/amostra. Não significa que a PCR detecte uma célula no tubo, e sim que o protocolo completo, enriquecimento incluído, a detecta partindo dessa contaminação nessa porção. Por isso 375 g e 25 g não são comparáveis sem olhar o protocolo de enriquecimento de cada um.
Algumas fichas separam duas sensibilidades. O Ampliora 4.3 Yeast declara 1x10⁰ UFC/mL em amostra enriquecida e 1x10³ células/mL em amostra direta: são dois números diferentes que não devem ser confundidos. E os painéis WaterScan expressam sua sensibilidade como uma faixa, de 5x10⁰ a 5x10¹ UFC/mL.
LOD, LOD50 e RLOD
Em um método qualitativo, a detecção em níveis muito baixos é probabilística: com poucas células por porção, algumas porções as contêm e outras não. A ISO 16140-2 compara o nível de detecção do método alternativo com o do método de referência por meio do RLOD, que define como o quociente entre os dois LOD. O estudo usa amostras contaminadas artificialmente em pelo menos três níveis; o nível baixo idealmente se situa no nível teórico de detecção, 0,7 UFC por porção, e deve dar entre 25 % e 75 % de positivos com o método de referência. O limite de aceitabilidade é 1,5 em estudos pareados e 2,5 em não pareados; um LOD menor que o de referência é sempre aceito. A AOAC, por sua vez, expressa o desempenho como probabilidade de detecção (POD): a proporção de resultados positivos para uma matriz e um nível de analito dados. O LOD50 e sua incerteza são desenvolvidos em limite de detecção e LOD50.
Inclusividade e exclusividade: a especificidade em números
Uma ficha pode dizer "detecção de Salmonella spp.", mas essa frase se apoia em um estudo concreto:
- Inclusividade. A capacidade do método de detectar o microrganismo-alvo em uma ampla gama de cepas. A ISO 16140-2 exige pelo menos 50 culturas puras do alvo e, para métodos de Salmonella, pelo menos 100 culturas de sorotipos diferentes. Cada cepa é inoculada em um nível de 10 a 100 vezes o nível mínimo de detecção do método e processada com o protocolo completo, incluído o enriquecimento.
- Exclusividade. A ausência de interferência de cepas não alvo relevantes. A ISO 16140-2 exige pelo menos 30 culturas puras não alvo. A AOAC a define como um estudo com cepas não alvo potencialmente reativas que não devem ser detectadas.
A norma pede ainda escolher as cepas de acordo com o princípio de medição do método. Ao ler uma ficha, a pergunta útil é com quantas cepas e sorotipos a detecção foi demonstrada e contra quais não alvos. Esse dado costuma estar no relatório de validação, não na ficha resumida, e é razoável pedi-lo.
Matrizes validadas: o campo que define o escopo real
As matrizes das fichas da TAAG são concretas. O Ampliora 1.1 declara coxa de frango crua, hambúrguer bovino congelado, linguiça (longanicilla), mortadela e superfície. O Ampliora 3.9 declara repolho, alface, espinafre, uma mistura de folhas verdes (alface, repolho e espinafre em partes iguais) e carne bovina moída crua (80 % magra). O Specio 4.1 lista uma longa série de alimentos preparados, carnes, laticínios, ovo líquido pasteurizado e superfícies vivas e inertes, e suas matrizes AOAC são superfícies de aço inoxidável, leite líquido pasteurizado com 2 % de gordura e hortaliça folhosa (alface). O Elevia 1.1 declara chocolate recheado do tipo avelã, chocolate recheado do tipo leite, barra de chocolate com amendoim, creme de avelã e cacau, carne em músculo inteiro, carne bovina moída (90 % magra), pellets de ração animal, ovos líquidos pasteurizados e superfícies de aço inoxidável.
Isso importa por duas razões. A primeira é a inibição: uma revisão do Instituto Federal Alemão de Avaliação de Riscos (Schrader e colaboradores, 2012) descreve que as substâncias inibidoras presentes na amostra podem reduzir a sensibilidade da PCR ou produzir falsos negativos, e que algumas são próprias de certos tipos de amostra, o que obriga a protocolos de extração específicos por matriz. A segunda é a microbiota acompanhante e o estado das células: a ISO 16140-2 pede que uma validação inclua produtos com microbiota de fundo alta e baixa, diferentes estresses de processo e produtos crus.
A norma também fixa o escopo: se um método é declarado para uma "ampla gama de alimentos", devem ser estudadas pelo menos cinco categorias, com pelo menos três tipos por categoria. O Regulamento (CE) 2073/2005 admite métodos alternativos validados frente ao de referência e, se forem proprietários, certificados por um terceiro segundo a ISO 16140 ou outros protocolos internacionais semelhantes. Se o seu produto não aparece entre as matrizes, a ficha não diz que o kit falha: diz que ninguém o demonstrou ainda. A verificação no próprio laboratório, segundo a ISO 16140-3, é explicada em validação e verificação de métodos.
Conservação e vida útil
Todos os kits de PCR do catálogo da TAAG são conservados entre -25 °C e -15 °C. A vida útil declarada é de 9 meses para a maioria (por exemplo, Ampliora 1.1, Ampliora 3.9 e Specio 4.1) e de 6 meses para os kits Elevia. Os meios têm condições próprias: o Augmentis 14 é conservado entre 2 °C e 25 °C com 6 meses de vida útil, e o Nucleia 2 Tez-Q Plus entre 2 °C e 25 °C com 12 meses. A vida útil mais curta do conjunto condiciona as compras.
Certificações e versão da ficha
O Ampliora 3.9 declara "Certified by AOAC by extension of License Number 032501" e o Specio 4.1, "Certified by AOAC by extension of License Number 072101". A ficha do Elevia 1.1 publicada em taag.bio acrescenta "Certified by AOAC by extension of License Number 072601", com um escopo PTM de chocolate 62 % cacau, liquor de cacau, leite em pó desnatado e amendoim (375 g cada um) e superfícies de aço inoxidável de 100 cm², sem o protocolo "zero". O escopo certificado e a lista de matrizes validadas são campos diferentes e não precisam coincidir. A palavra "extensão" indica que o escopo de uma licença existente foi ampliado, e cada certificação cobre as matrizes e alvos avaliados naquele estudo, como se explica em o que é a certificação AOAC-PTM. Em uma auditoria, é preciso cruzar o número da licença, as matrizes certificadas e a matriz real do laboratório.
As fichas também têm número e data de revisão. A do Ampliora 1.1, por exemplo, está na revisão 4, de 7 de outubro de 2025. Convém arquivar a versão vigente junto com os registros de verificação.
Quais kits e tecnologias da TAAG aparecem neste artigo
O Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97) e o Ampliora 3.9 (V-SF68) são PCR em tempo real com sondas fluorescentes desenhadas com Mila; o Specio 4.1 (V-SF95) usa fluoróforo intercalante com curva de melting interpretada com KAi; o Elevia 1.1 Salmonella spp. (V-PAT04) é RT-qPCR sobre RNA com tecnologia AiGOR. Nos quatro casos, a ficha indica que o software TxA interpreta as curvas de forma automática. Se a matriz ou o equipamento do laboratório não coincidirem com os declarados, cabe verificar antes de usar o resultado.
Conclusão
A ficha técnica de um kit de PCR descreve as condições em que o método foi demonstrado: com qual meio e qual extração, em qual equipamento e com quais canais, para qual porção e quais matrizes, e com qual estudo de inclusividade, exclusividade e nível de detecção. Lê-la bem significa separar o tempo de PCR do tempo total, entender que a sensibilidade se refere a uma porção e a um protocolo completo, e cruzar as matrizes e a certificação com o que o laboratório realmente analisa. Quando algo não coincide, a ficha não diz que o kit falha, e sim que é preciso verificá-lo antes de decidir com seu resultado.
Sobre a TAAG
Revise com a TAAG a ficha técnica do Ampliora 1.1 Salmonella spp., do Ampliora 3.9 ou do Specio 4.1 frente à sua matriz e ao seu termociclador.
Perguntas frequentes
O tempo de PCR da ficha é o tempo total até o resultado?
Não. O tempo de PCR corresponde apenas à corrida no termociclador. Ao tempo total é preciso somar o enriquecimento, que consta na ficha do meio de cultura (por exemplo, 24 ± 2 horas no Augmentis 14 Universal Gram negative), a extração e a manipulação.
O que significa uma sensibilidade de 1 UFC/25 g?
Que o protocolo completo, com seu enriquecimento, detecta o microrganismo partindo dessa contaminação em uma porção de 25 g. Não quer dizer que a PCR detecte uma única célula no tubo, e a detecção em níveis tão baixos é probabilística, por isso as normas a avaliam com LOD50, RLOD ou POD.
O que são a inclusividade e a exclusividade de um kit?
A inclusividade é a capacidade de detectar o microrganismo-alvo em muitas cepas diferentes; a ISO 16140-2 exige pelo menos 50 cepas, e 100 sorotipos no caso de Salmonella. A exclusividade é o método não responder a cepas não alvo relevantes; a norma exige pelo menos 30.
Posso usar um kit em uma matriz que não consta na ficha?
Pode, mas esse uso não está respaldado pela validação do fabricante. Antes de usar o resultado para decidir, o laboratório deve verificar o método em sua matriz, por exemplo segundo a ISO 16140-3, porque a inibição da PCR e a microbiota acompanhante mudam de um alimento para outro.
Um kit funciona em qualquer termociclador de tempo real?
Não necessariamente. O equipamento deve ler os canais de fluorescência que o kit usa e estar entre os equipamentos em que o desempenho foi verificado. No catálogo da TAAG, o Ampliora 3.5 e o Ampliora 3.5R buscam os mesmos microrganismos, mas declaram plataformas e fluoróforos diferentes.