Validation et vérification des méthodes microbiologiques : ce qu'exige la série ISO 16140

Deux questions distinctes sur une même méthode

Avant d'utiliser une méthode microbiologique en routine, un laboratoire doit répondre à deux questions. La première est de savoir si la méthode fonctionne : détecte-t-elle ou quantifie-t-elle le micro-organisme cible avec une performance acceptable par rapport à une référence reconnue. La seconde est de savoir si elle fonctionne entre ses mains, avec son personnel, ses équipements et les aliments qu'il analyse chaque jour. La première question trouve sa réponse dans la validation ; la seconde, dans la vérification.

La distinction n'est pas un détail technique. La norme ISO/IEC 17025:2017, qui régit la compétence des laboratoires d'essais, exige que le laboratoire vérifie qu'il peut appliquer correctement une méthode avant de l'introduire, en démontrant qu'il atteint la performance requise et en conservant les enregistrements. Une méthode validée que personne n'a vérifiée dans le laboratoire qui l'utilise laisse un vide qui apparaît souvent lors des audits. Les exigences d'accréditation sont développées dans l'article sur l'ISO/IEC 17025 dans les laboratoires alimentaires.

Validation : établir la performance de la méthode

La validation consiste à déterminer les caractéristiques de performance d'une méthode et à apporter des preuves objectives qu'elle satisfait aux exigences pour un usage prévu. En microbiologie alimentaire, cela signifie presque toujours comparer une méthode alternative (par exemple un kit de PCR ou un milieu chromogène) à une méthode de référence, qui est généralement un protocole de culture traditionnelle normalisé comme l'ISO 6579-1 pour Salmonella.

La série ISO 16140

Le comité technique ISO/TC 34/SC 9 a remplacé l'ancienne ISO 16140:2003 par une série de normes, chacune conçue pour un scénario différent :

• ISO 16140-1:2016 : vocabulaire commun de la validation.
• ISO 16140-2:2016 : protocole pour valider des méthodes alternatives, pour la plupart commerciales, par rapport à une méthode de référence. Elle fait l'objet d'un amendement publié en 2024 qui a révisé une partie des calculs.
• ISO 16140-3:2021 : protocole pour vérifier, dans un seul laboratoire, des méthodes de référence et des méthodes alternatives déjà validées.
• ISO 16140-4 : validation dans un seul laboratoire. Ses résultats ne sont valables que pour le laboratoire qui a réalisé l'étude.
• ISO 16140-5 : validation interlaboratoires factorielle pour des méthodes non commerciales, avec moins de laboratoires participants que dans la partie 2.
• ISO 16140-6:2019 : validation de méthodes alternatives de confirmation et de typage, qui partent d'une colonie suspecte et non d'un échantillon d'aliment.

La série est complétée par l'ISO 17468, qui fixe les exigences techniques pour établir ou réviser une méthode de référence normalisée.

Ce que comprend une validation selon l'ISO 16140-2

Le protocole comporte deux phases. La première est une étude comparative réalisée dans un laboratoire organisateur : on analyse des échantillons contaminés avec les deux méthodes pour mesurer la sensibilité, on détermine le niveau de détection relatif (RLOD) et l'on vérifie l'inclusivité et l'exclusivité avec 50 souches du micro-organisme cible et 30 souches non cibles. Pour les méthodes quantitatives, l'étude comparative évalue la justesse relative et le profil d'exactitude. La seconde phase est une étude interlaboratoires, dans laquelle plusieurs laboratoires analysent les mêmes échantillons pour estimer la reproductibilité de la méthode.

Le domaine d'application de la validation dépend des catégories d'aliments étudiées. Pour déclarer une méthode valide pour une « large gamme d'aliments », au moins cinq catégories doivent être couvertes. Cette déclaration de domaine d'application est la première chose à contrôler dans un certificat.

Qui certifie

En Europe, des organismes indépendants comme MicroVal, NF Validation (AFNOR) et NordVal (NMKL) délivrent des certificats fondés sur l'ISO 16140-2 et publient les rapports sur leurs sites. Aux États-Unis, le schéma le plus répandu est celui d'AOAC International, que nous expliquons dans le guide sur la certification AOAC-PTM.

Ce que dit la réglementation européenne

Le Règlement (CE) 2073/2005 établit dans son article 5 que les méthodes analytiques de l'annexe I sont les méthodes de référence, et que l'usage de méthodes alternatives est acceptable lorsqu'elles sont validées par rapport à cette référence et, si elles sont commerciales, certifiées par un tiers selon le protocole de l'EN ISO 16140 ou d'autres protocoles similaires acceptés internationalement. Le Règlement (UE) 2019/229 a ajouté des définitions clés : ce que l'on entend par « large gamme d'aliments » et ce qu'est un organisme de certification indépendant du fabricant de la méthode.

Vérification : démontrer que la méthode fonctionne dans votre laboratoire

L'ISO 16140-3 définit la vérification comme la démonstration qu'une méthode validée fonctionne entre les mains de l'utilisateur conformément aux spécifications de sa validation. Elle divise le processus en deux étapes.

Étape 1 : vérification de la mise en œuvre

Le laboratoire démontre qu'il sait exécuter la méthode en utilisant un seul aliment, choisi parmi ceux analysés lors de l'étude de validation. Si les résultats sont proches de ceux de la validation, le problème de fond (la technique) est résolu.

Étape 2 : vérification des aliments du laboratoire

Le laboratoire démontre ensuite que la méthode fonctionne avec les aliments qu'il déclare analyser. Pour cela, il choisit un aliment « difficile » dans chaque catégorie incluse dans son domaine d'application : produits à faible activité de l'eau, contenant des antimicrobiens naturels comme les épices, de la lécithine, ou beaucoup de matière grasse. Le guide de formation du comité ISO lui-même donne des exemples comme la crème glacée, l'œuf en poudre, la viande assaisonnée et le cacao en poudre.

Ce que l'on mesure et avec quel critère d'acceptation

Méthodes qualitatives : eLOD50

Pour les méthodes de détection, on estime le niveau de détection à 50 % (eLOD50) : la contamination à laquelle la méthode donne un résultat positif dans la moitié des portions analysées. On parle de niveau « estimé » parce que le nombre d'échantillons est bien inférieur à celui d'une validation complète. Le critère d'acceptation est que l'eLOD50 obtenu ne dépasse pas quatre fois le LOD50 de la validation. Dans l'exemple du guide de formation ISO pour Salmonella selon l'ISO 6579-1, le LOD50 de référence était de 5,7 UFC, la limite se situait à 22,8 UFC et le laboratoire a obtenu 3,0 UFC, ce qui était conforme. Le concept de LOD50 est développé dans l'article sur la limite de détection et l'incertitude de mesure.

Méthodes quantitatives : reproductibilité et biais

Pour les dénombrements, la vérification de la mise en œuvre mesure l'écart-type de reproductibilité intralaboratoire (S_IR), avec un plan aligné sur l'ISO 19036. Le critère est qu'il ne dépasse pas le double de la plus petite valeur moyenne de reproductibilité obtenue lors de la validation. La vérification des aliments mesure le biais estimé (eBias) : des portions sont contaminées à trois niveaux, en duplicat, et l'écart par rapport au niveau attendu ne doit dépasser 0,5 log₁₀ à aucun niveau.

Méthodes de confirmation et de typage

Ici, seule la vérification de la mise en œuvre est exigée : on teste des souches cibles et non cibles (dans l'exemple du guide, cinq de chaque type) et l'on exige 100 % de concordance avec le résultat attendu.

L'échéance de 2028 pour les méthodes de référence non validées

De nombreuses normes ISO de référence ont été publiées sans données de performance. Pour elles, l'ISO 16140-3 propose un protocole transitoire dans son annexe F. Selon le document de transition du comité ISO, cette annexe peut être utilisée jusqu'au 31 décembre 2027 ; à partir du 1er janvier 2028, seules les méthodes de référence validées pourront être vérifiées conformément à l'ISO 16140-3. Les normes ISO sont volontaires, mais les organismes d'accréditation les prennent généralement comme critère.

Le même document précise quand il faut vérifier à nouveau. Une méthode déjà accréditée n'a pas besoin d'une nouvelle vérification sauf si elle change. Une nouvelle méthode ou une nouvelle catégorie d'aliments dans le domaine d'application en ont besoin. Si une méthode validée subit une modification technique majeure ayant un impact notable, également.

Si la vérification n'est pas conforme

La norme demande une analyse des causes racines avant de recommencer. Les causes habituelles sont la préparation et le niveau de l'inoculum, l'homogénéisation de l'échantillon, l'étalonnage des équipements, les lots de milieux ou de réactifs et l'application du protocole par l'analyste. Si le problème persiste, l'étape suivante est de consulter le fournisseur de la méthode (si elle est commerciale), l'organisme de normalisation (si elle est de référence) ou l'organisme de certification.

Erreurs courantes

• Considérer comme acquis qu'un certificat de validation remplace la vérification dans le laboratoire.
• Appliquer la méthode à des aliments d'une catégorie qui ne figure pas dans le domaine d'application de sa validation.
• Vérifier uniquement avec un aliment « facile » et non avec un aliment représentatif des difficultés réelles du laboratoire.
• Ne pas conserver les enregistrements de vérification, qui sont exigibles au titre de l'ISO/IEC 17025.
• Modifier une étape du protocole, comme la durée d'enrichissement, et continuer de traiter la méthode comme validée.