Cet article suit l'échantillon après le transport et la conservation des échantillons et complète les plans d'échantillonnage par attributs avec ce qui se passe à l'intérieur du laboratoire.
Sommaire
L'étape que personne ne voit dans le rapport
Un résultat microbiologique est rapporté sous la forme « absence dans 25 g » ou « 3 200 UFC/g », mais entre le sachet qui arrive au laboratoire et la boîte ou le bouillon, il existe une étape qui n'apparaît presque jamais dans le rapport : la préparation de l'échantillon. Combien on pèse, dans quel diluant, combien de temps on homogénéise, combien de temps attend la suspension et si l'on regroupe des portions : chaque décision change ce que signifie le chiffre. Le prélèvement en usine est traité dans échantillonnage des surfaces et l'acheminement jusqu'au laboratoire dans transport et conservation des échantillons ; cet article commence là où ceux-ci s'arrêtent, avec l'échantillon déjà reçu.
La référence internationale pour cette étape est la série ISO 6887, du comité ISO/TC 34/SC 9. Elle comprend six parties : la 6887-1:2017 fixe les règles générales et les cinq autres les déclinent par groupes de produits : viandes (6887-2:2017), poissons et produits de la pêche (6887-3:2017), produits divers comme les œufs, les végétaux, le cacao, les herbes et les épices (6887-4:2017), lait et produits laitiers (6887-5:2020) et échantillons de production primaire, de la ferme à l'abattoir (6887-6:2013). Si la méthode spécifique d'un micro-organisme comporte ses propres instructions, celles-ci prévalent.
La suspension mère au 1:10, étape par étape
Pesée et proportion
L'ISO 6887-1 demande de peser ou de mesurer la prise d'essai avec une tolérance de ±5 %, avec un minimum de 10 g ou 10 mL sauf indication contraire de la méthode, et d'ajouter 9 fois cette quantité de diluant, mesuré de préférence en masse avec une tolérance de ±2 %. On obtient ainsi la dilution 1:10. La norme admet d'autres proportions lorsque c'est nécessaire : 1 pour 20, 1 pour 50 ou 1 pour 100 pour les produits qui donnent des suspensions trop épaisses, et 1 pour 2 ou 1 pour 5 lorsqu'on recherche de faibles dénombrements, tout en avertissant que ces dernières peuvent déséquilibrer le rapport entre inoculum et milieu et doivent être vérifiées au cas par cas. Toute proportion non standard est reportée dans le calcul final.
Diluants
Pour un usage général, la norme définit deux diluants : la solution peptone-sel (1 g de digestat enzymatique de caséine et 8,5 g de chlorure de sodium par litre) et l'eau peptonée tamponnée, toutes deux avec un pH final de 7,0 ± 0,2 à 25 °C. Il existe en outre une version double concentration de l'eau peptonée tamponnée pour les produits très acides. Le volume final ne peut pas s'écarter de plus de ±2 % et les diluants doivent réussir un essai de performance : après 45 minutes à 1 heure à température ambiante, le dénombrement de la souche de contrôle doit rester à ±30 % de la valeur initiale. Les exigences de performance des diluants et des milieux sont détaillées dans l'ISO 11133.
Homogénéisation
Le mélange est homogénéisé selon l'ISO 7218 (quatrième édition, de 2024), avec un homogénéisateur rotatif (mixeur de laboratoire) ou péristaltique, l'appareil à palettes qui frappe un sachet stérile et que l'on appelle couramment stomacher dans les laboratoires. Si nécessaire, on laisse sédimenter les grosses particules jusqu'à 15 minutes ; les sachets à filtre intégré sont une alternative équivalente. Pour les produits durs ou secs, la norme limite l'homogénéisateur rotatif à 2,5 minutes consécutives et le hachage ou le broyage préalable à 1 minute, afin d'éviter que l'échantillon ne s'échauffe. Le manuel de la FDA pour les aliments (BAM, chapitre 1) utilise pour les dénombrements 50 g d'échantillon dans 450 mL de diluant phosphate de Butterfield, mixés pendant 2 minutes.
Délais maximaux
L'ISO 6887-1 établit qu'entre la fin de la préparation de la suspension mère et le contact de l'inoculum avec le milieu de culture final, il ne doit pas s'écouler plus de 45 minutes, et qu'entre la suspension mère et le début des dilutions, il ne doit pas s'écouler plus de 30 minutes. Si la température du laboratoire dépasse 27 °C, ces deux délais devraient être raccourcis. Le BAM est plus strict : pas plus de 15 minutes entre l'homogénéisation et le moment où toutes les dilutions sont dans leurs milieux. Dans une suspension riche en nutriments, les micro-organismes peuvent commencer à se multiplier et le résultat est alors plus élevé que celui de l'échantillon réel.
Dilutions décimales
Pour chaque palier décimal, on transfère 1 mL ± 0,02 mL dans un tube contenant 9 mL ± 0,2 mL de diluant, sans plonger la pipette de plus de 1 cm, en mélangeant pendant 5 à 10 secondes et avec un nouvel embout à chaque palier.
Règles par type d'aliment
Produits surgelés
Pour les petits emballages (en général moins de 2 kg), l'ISO 6887-1 permet de les amener à une consistance qui permette de prélever la portion, à 18-27 °C pendant 3 heures au maximum ou à 5 ± 3 °C pendant 24 heures au maximum, et déconseille la décongélation au bain-marie ou sous le jet d'eau, en raison du risque de contamination si l'emballage n'est pas étanche. Le BAM préfère ne pas décongeler et, si nécessaire, le fait à 2-5 °C en 18 heures au maximum, ou en dessous de 45 °C pendant 15 minutes au plus avec agitation dans un bain thermostaté.
Viandes
L'ISO 6887-2 couvre les viandes fraîches, réfrigérées, congelées, saumurées, fermentées, hachées, les préparations de viandes, les viandes séparées mécaniquement, les viandes cuites, séchées et fumées, les extraits concentrés et les échantillons de carcasse prélevés par excision ou écouvillonnage. Elle distingue, entre autres cas, les blocs et les morceaux, les saucisses avec boyau et les échantillons de surface ou de profondeur. Le prélèvement sur carcasse relève de l'ISO 17604. Le contexte de la filière figure dans microbiologie dans l'industrie de la viande.
Produits laitiers
L'ISO 6887-5 comporte des modes opératoires propres pour le lait liquide, le lait et le lactosérum en poudre, les fromages, les caséines et caséinates (avec un cas particulier pour la caséine présure), le beurre, les glaces, les desserts lactés de pH supérieur à 5, les laits fermentés et yaourts de pH inférieur à 5 et les préparations pour nourrissons en poudre. Le BAM illustre pourquoi on ne peut pas tout traiter de la même façon : pour Salmonella dans le fromage, il mixe 25 g avec 225 mL de bouillon lactosé pendant 2 minutes, laisse reposer 60 minutes et ajuste le pH à 6,8 ± 0,2 ; le lait écrémé en poudre instantané, en revanche, est versé délicatement à la surface du bouillon et incubé sans mélanger.
Poissons et fruits de mer
L'ISO 6887-3 couvre le poisson entier ou en filets, les crustacés, les céphalopodes, les mollusques bivalves, les gastéropodes, les tuniciers et les échinodermes, ainsi que les produits fumés, cuits et les blocs surgelés, et inclut des modes opératoires spéciaux pour les mollusques, tuniciers et échinodermes crus provenant de zones de production primaire.
Aliments secs, acides et gras
- Faible humidité : peser d'abord le diluant puis ajouter la portion, pour réduire le choc osmotique, et laisser tremper jusqu'à 1 heure si le produit est dur. Pour les poudres, le BAM ajoute d'abord environ 15 mL de bouillon, forme une suspension sans grumeaux et complète le volume par fractions.
- Acides : la suspension doit revenir à un pH de 7,0 ± 0,5. L'eau peptonée tamponnée suffit pour les produits de pH 4,5 ou plus ; entre pH 3,5 et 4,5, on peut utiliser la version double concentration, en vérifiant le pH la première fois.
- Gras (plus de 20 %) : on peut ajouter du polysorbate 80 au diluant, entre 1 et 10 g/L ; en général, 1 g/L par tranche de 10 % de matière grasse suffit.
- Épices inhibitrices : le BAM ajoute du sulfite de potassium à 0,5 % pour l'oignon et l'ail déshydratés, et dilue le piment de la Jamaïque, la cannelle et l'origan au 1:100 et le clou de girofle au 1:1000, car on ne connaît aucun moyen de neutraliser leur effet.
Composites et regroupés : ce n'est pas la même chose
Réunir des unités d'un même lot économise du travail et des réactifs. L'amendement 1 de 2024 à l'ISO 6887-1 précise deux notions qui se confondent souvent en pratique :
- Échantillon composite : on mélange plusieurs unités et l'on prélève dans le mélange une portion de la taille indiquée par la méthode, par exemple 25 g. Le résultat reste exprimé pour 25 g.
- Échantillon regroupé (pooling) : on réunit plusieurs unités ou portions et l'on analyse le mélange entier. Le résultat est exprimé pour la masse totale, par exemple 100 g ou 375 g.
Le regroupement peut se faire hors du laboratoire, en réunissant des échantillons individuels en un échantillon plus grand, ou au laboratoire, en réunissant des portions dans un seul grand pré-enrichissement ou en réunissant des bouillons déjà pré-enrichis. Les règles sont strictes : uniquement pour les essais qualitatifs, uniquement avec des unités de même origine (même lot ou même partie) et sans combiner deux modalités à la fois, par exemple regrouper des portions puis regrouper aussi leurs bouillons.
25 g ou 375 g : ce qui change en augmentant la prise d'essai
Le schéma classique vient du BAM : de chaque unité d'échantillon, on prélève une portion de 25 g et jusqu'à 15 portions peuvent être réunies en un composite de 375 g, analysé en totalité en conservant la proportion 1:9 (375 g dans 3 375 mL de bouillon). Le nombre d'unités dépend de la catégorie de l'aliment : 60 pour la catégorie I (sans étape létale et destiné aux personnes âgées, aux malades ou aux nourrissons), 30 pour la II et 15 pour la III, soit 4, 2 ou 1 composite de 375 g. Un seul positif entraîne le rejet du lot. Le BAM exclut de la composition, entre autres, le lait en poudre non instantané et le lait entier en poudre.
L'amendement de 2024 pose des conditions techniques pour que le grand volume ne masque pas un positif :
- Le bouillon de pré-enrichissement doit être préchauffé à la température d'incubation.
- Il faut connaître le profil de température du grand volume. En prenant l'exemple de l'ISO 6579-1, dont le pré-enrichissement dure entre 16 et 20 heures, le mélange doit être maintenu entre 34 °C et 38 °C pendant au moins 16 heures, et le temps nécessaire pour atteindre cette température doit être réduit au minimum.
- La proportion échantillon/diluant de la méthode validée ne change pas, sauf pour l'augmenter dans les matrices inhibitrices comme l'oignon en poudre, l'ail, l'origan, les piments, certains thés et cafés, les prémélanges vitaminiques ou les produits très salés.
- Un échantillon pour laboratoire supérieur au maximum est divisé : 750 g sont traités comme deux portions de 375 g.
En outre, la taille supérieure doit être validée. Si elle l'a été dans une étude selon l'ISO 16140-2 ou l'ISO 16140-5, chaque laboratoire doit seulement la vérifier selon l'ISO 16140-3 dans la même catégorie d'aliments ; sinon, il doit la valider lui-même avec le protocole de l'annexe H de l'amendement 1:2024 de l'ISO 16140-4, en démontrant avec le niveau relatif de détection (RLOD) que la LOD50 ne se dégrade pas. Une fois 375 g validés, des portions plus petites peuvent être utilisées à la même proportion. Ces notions sont expliquées dans validation et vérification des méthodes.
Les données appuient cette approche lorsqu'elle est bien appliquée. Tomás Fornés et ses collaborateurs ont validé le regroupement de prises d'essai jusqu'à 375 g pour Salmonella avec cinq méthodes (culture, ELISA et PCR en temps réel) sur 23 aliments (confiserie, préparation pour nourrissons, aliments pour animaux de compagnie, boissons en poudre, entre autres). Pour 22 des 23, le RLOD50 par rapport à 25 g était acceptable (inférieur à 2,5), à condition de préchauffer le bouillon et de respecter la durée maximale d'incubation. Le regroupement figure aussi dans la réglementation : le règlement (CE) n° 2073/2005 demande de réunir la peau du cou d'au moins trois carcasses de volaille du même troupeau d'origine en un échantillon de 26 g, et de regrouper les écouvillonnages de différents sites d'une carcasse avant l'analyse. La lecture de n et c dans ces plans est expliquée dans plans d'échantillonnage par attributs, et le caractère décisif de l'étape en bouillon dans enrichissement microbiologique.
Quels kits et milieux TAAG s'y rapportent
Le kit définit la prise d'essai pour laquelle il est validé. Dans le catalogue TAAG, Elevia 1.1 Salmonella spp. (V-PAT04, RT-qPCR avec technologie AiGOR) déclare une sensibilité de 1 UFC/375 g dans les aliments et de 1 UFC/échantillon sur les surfaces ; sa certification AOAC couvre des prises de 375 g de chocolat à 62 % de cacao, de liqueur de cacao, de lait écrémé en poudre et de cacahuètes, et TAAG déclare aussi des matrices validées telles que les chocolats fourrés, le bœuf haché (90 % maigre), les granulés d'aliments pour animaux, les œufs liquides pasteurisés et les surfaces en acier inoxydable. Sa fiche technique cite le supplément Potentia 1 Salmonella spp. (V-PET06), un activateur de croissance pour l'eau peptonée tamponnée. Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97, PCR en temps réel) déclare 1 UFC/25 g, avec comme matrices validées la cuisse de poulet crue, le steak haché de bœuf surgelé, la saucisse de type longaniza, la mortadelle et les surfaces, et il est associé à Augmentis 14 Universal Gram negative (V-FL46, flacons de 225 mL, le volume de bouillon pour 25 g au 1:10). Utiliser un kit avec une prise d'essai, une matrice ou un schéma de regroupement différents de ceux déclarés exige la vérification ou la validation que demande l'amendement de l'ISO 6887-1. Pour choisir selon la matrice, voir comment choisir un kit TAAG.
Conclusion
La préparation de l'échantillon détermine ce que représente un résultat autant que la méthode de détection. L'ISO 6887-1 fixe la suspension mère au 1:10, des diluants contrôlés, une homogénéisation sans échauffer l'échantillon et un maximum de 45 minutes jusqu'à l'ensemencement, et les parties 2 à 6 adaptent ces règles aux viandes, poissons, produits laitiers, produits secs et à la production primaire. Composer ou regrouper des portions pour les pathogènes est un outil valable et étayé par des données, mais seulement avec des unités du même lot, un bouillon préchauffé, une proportion constante et une taille de prise d'essai validée. Consigner ces décisions par écrit dans la procédure du laboratoire est ce qui permet de comparer les résultats entre équipes, analystes et laboratoires.
À propos de TAAG
Vérifiez avec TAAG si Elevia 1.1 Salmonella spp. ou Ampliora 1.1 Salmonella spp. sont validés pour la prise d'essai et le schéma de pooling qu'utilise votre laboratoire.
Questions fréquentes
Pourquoi la suspension mère est-elle préparée au 1:10 ?
Parce que l'ISO 6887-1 définit la dilution primaire comme la prise d'essai mélangée avec, normalement, neuf fois sa quantité de diluant, ce qui constitue la base d'une série décimale. La norme admet d'autres proportions, comme 1 pour 20 ou 1 pour 100 pour les produits épais, à condition d'en tenir compte dans le calcul du résultat.
Combien de temps une suspension peut-elle attendre avant d'être ensemencée ?
Selon l'ISO 6887-1, pas plus de 45 minutes entre la fin de la suspension mère et le contact de l'inoculum avec le milieu final, et pas plus de 30 minutes avant de commencer les dilutions. Si la température du laboratoire dépasse 27 °C, ces délais devraient être raccourcis. Le BAM de la FDA fixe un maximum de 15 minutes entre l'homogénéisation et la mise en milieu de toutes les dilutions.
Quelle différence entre un échantillon composite et un échantillon regroupé ?
Dans le composite, on mélange plusieurs unités et l'on analyse une portion de la taille prévue par la méthode, par exemple 25 g, et le résultat est exprimé pour 25 g. Dans le regroupé, on analyse le mélange entier, par exemple 375 g, et le résultat est exprimé pour cette masse totale. Les deux sont réservés aux essais qualitatifs et aux unités d'un même lot.
Peut-on analyser 375 g au lieu de 25 g pour Salmonella ?
Oui, si la méthode est validée pour cette prise d'essai plus grande et si l'on respecte les conditions de l'amendement 1:2024 de l'ISO 6887-1 : bouillon préchauffé, profil de température connu et même proportion échantillon/diluant. Si la taille n'a pas été validée selon l'ISO 16140-2 ou 16140-5, le laboratoire doit la valider avec le protocole de l'annexe H de l'amendement de l'ISO 16140-4.
Comment décongeler un échantillon avant l'analyse ?
L'ISO 6887-1 permet de laisser les petits emballages à 18-27 °C jusqu'à 3 heures ou à 5 ± 3 °C jusqu'à 24 heures, et déconseille le bain-marie ou le jet d'eau froide. Le BAM préfère ne pas décongeler et, si nécessaire, utilise 2-5 °C pendant 18 heures au maximum ou moins de 45 °C pendant 15 minutes au plus avec agitation.