Essais d'aptitude et comparaisons interlaboratoires en microbiologie des aliments : ce qu'exigent les normes et comment lire un z-score

Qu'est-ce qu'un essai d'aptitude et en quoi diffère-t-il d'autres comparaisons

Un laboratoire disposant de méthodes validées et d'analystes formés peut porter un biais que personne ne détecte de l'intérieur. Le moyen de le voir est de comparer ses résultats à ceux d'autres laboratoires qui analysent le même matériau. L'ISO/IEC 17043:2023 définit la comparaison interlaboratoires comme l'organisation, l'exécution et l'évaluation de mesures ou d'essais sur des entités identiques ou similaires par deux laboratoires ou plus, selon des conditions prédéterminées. L'essai d'aptitude (en anglais, proficiency testing ou PT) en est un cas particulier : il évalue la performance de chaque participant par rapport à des critères fixés à l'avance, au moyen d'une comparaison interlaboratoires.

Toute comparaison n'évalue pas le laboratoire. Une étude interlaboratoires visant à obtenir les caractéristiques de performance d'une méthode, comme celles de la série ISO 16140 décrite dans validation et vérification des méthodes microbiologiques, mesure la méthode et non le participant.

Ce qu'exige l'ISO/IEC 17025

L'article 7.7 de l'ISO/IEC 17025:2017 demande une procédure pour assurer la validité des résultats. Le paragraphe 7.7.1 regroupe les mesures internes (matériaux de référence, contrôles, répétitions, comparaison entre analystes) et le 7.7.2 ajoute le regard externe : le laboratoire doit surveiller sa performance en la comparant aux résultats d'autres laboratoires, au moyen d'essais d'aptitude ou d'autres comparaisons interlaboratoires, lorsqu'ils sont disponibles et appropriés. Le cadre général de l'accréditation figure dans accréditation ISO/IEC 17025 des laboratoires d'analyse des aliments.

La politique ILAC-P9:01/2024, qu'appliquent les organismes d'accréditation signataires de l'arrangement de reconnaissance mutuelle de l'ILAC, traduit cette exigence en règles concrètes :

• La participation est considérée comme obligatoire lorsque l'essai d'aptitude est disponible, approprié et jugé nécessaire selon l'analyse des risques du laboratoire.
• Le laboratoire doit disposer d'un plan de participation, que l'organisme d'accréditation évalue avant d'accorder l'accréditation pour vérifier qu'il couvre la portée de manière représentative.
• Lorsque la performance n'est pas satisfaisante, l'organisme évalue les preuves d'actions correctives rapides et adéquates.

Niveau et fréquence de participation

Personne ne participe à un essai pour chaque combinaison de méthode, d'analyte et de matrice. L'ILAC-P9, suivant le guide EA-4/18 G:2021, propose de regrouper la portée en domaines de compétence technique : des combinaisons de technique, de caractéristique et de produit suffisamment équivalentes pour que le résultat de l'une représente les autres. Des techniques différentes entrent rarement dans un même domaine ; des produits différents, oui, si les matrices sont de nature équivalente. La fréquence minimale par domaine est fixée par le laboratoire en fonction du risque : volume d'analyses, rotation et expérience du personnel, stabilité de l'analyte et de la matrice, robustesse de la méthode et usage final de la donnée. Le guide cite la sécurité des aliments parmi les domaines qui requièrent un niveau d'assurance élevé.

Les trois normes qui encadrent un essai d'aptitude en microbiologie

ISO/IEC 17043:2023 : la compétence de l'organisateur

Elle fixe les exigences de compétence et d'impartialité des organisateurs d'essais d'aptitude. La deuxième édition, de mai 2023, a remplacé celle de 2010 qui, selon l'ILAC-P9, restait valable jusqu'en mai 2026. Pour le participant, la question pratique est de savoir si l'organisateur est accrédité selon cette norme par un organisme signataire de l'arrangement de l'ILAC, ce qui est le moyen reconnu de démontrer sa compétence.

ISO 13528:2022 : la statistique

Elle décrit les méthodes statistiques pour concevoir les programmes et analyser leurs données, et donne des recommandations pour interpréter les résultats, quantitatifs comme qualitatifs. La troisième édition date d'août 2022 et a fait l'objet d'un amendement publié en 2026. On y trouve les méthodes pour fixer la valeur assignée (la valeur de référence du tour), l'écart-type pour l'évaluation de l'aptitude (σ_pt, qui définit la tolérance) et les scores de performance.

ISO 22117:2019 : la spécificité de la microbiologie

Elle a remplacé la spécification technique ISO/TS 22117:2010 et a été confirmée lors de son examen systématique. Elle établit des exigences et des recommandations pour organiser des programmes d'essais d'aptitude en microbiologie des aliments et boissons, des aliments pour animaux, des échantillons d'environnement de la production et de la manipulation des aliments et des aliments pour animaux, et de la production primaire ; ainsi que de l'eau utilisée dans la production d'aliments ou considérée comme un aliment par la législation nationale. Elle couvre l'organisation technique du programme et le traitement statistique des résultats, et elle est conçue pour être utilisée avec l'ISO/IEC 17043 et l'ISO 13528 : elle n'ajoute que ce dont la microbiologie a besoin en plus. La préparation du matériau en est un exemple : un programme mené en 2021 en Inde pour Listeria monocytogenes et Salmonella dans des crevettes lyophilisées a vérifié l'homogénéité et la stabilité de l'entité pendant le stockage (jusqu'à 28 jours) et le transport (jusqu'à 6 jours) avant de l'expédier.

Comment lire un z-score

Le score le plus utilisé est le z-score : z = (x_i − x_pt) / σ_pt, où x_i est le résultat du laboratoire, x_pt la valeur assignée et σ_pt l'écart-type pour l'évaluation. L'interprétation habituelle, issue de l'ISO 13528 et reprise par le guide Eurachem de 2021, est la suivante :

• |z| ≤ 2,0 : performance satisfaisante, aucun signal.
• 2,0 < |z| < 3,0 : performance discutable, signal d'avertissement.
• |z| ≥ 3,0 : performance insatisfaisante, signal d'action.

Un exemple illustratif : si la valeur assignée d'un dénombrement est de 4,20 log UFC/g, que σ_pt vaut 0,25 log et que le laboratoire rapporte 4,85 log UFC/g, z = 0,65 / 0,25 = 2,6 : discutable. Ce que représente une UFC et comment s'interprète un dénombrement est expliqué dans ce que sont les UFC.

Deux mises en garde. Premièrement, le z-score dépend de σ_pt : plus il est grand, plus z est petit et meilleure semble la performance ; il convient donc de vérifier si cette valeur a du sens au regard de l'usage que le laboratoire fait de ses résultats. Deuxièmement, le z-score ne tient pas compte de l'incertitude de la valeur assignée. Si cette incertitude-type est inférieure à 0,3·σ_pt, elle est considérée comme négligeable ; sinon, l'organisateur doit utiliser une autre façon de fixer la valeur assignée, des scores qui l'intègrent, comme z′ ou zêta (ζ), ou en informer les participants. La relation entre ces scores et l'incertitude du laboratoire lui-même est traitée dans limite de détection et incertitude de mesure.

Essais qualitatifs : quand le résultat est détecté ou non détecté

La plupart des analyses de pathogènes sont des analyses de présence ou d'absence, et calculer des moyennes ou des écarts-types n'y a pas de sens. L'ISO 13528 prévoit de fixer la valeur assignée à partir de la préparation connue de l'entité, de matériaux de référence ou d'un jugement d'expert, et la performance est évaluée selon des critères de réponses correctes sur des échantillons positifs et négatifs. L'essai de 2024 du laboratoire de référence de l'UE pour Salmonella, dont la conception générale repose sur l'ISO 22117, montre comment procéder :

• Soixante-huit laboratoires nationaux de référence y ont participé ; ils ont analysé selon l'EN ISO 6579-1 des chiffonnettes contaminées par S. Typhimurium à différents niveaux et des échantillons non contaminés.
• Le critère de bonne performance exigeait au moins 2 positifs sur 3 au niveau élevé (37,5 UFC par échantillon), au moins 2 sur 4 au niveau bas (4,5 UFC par échantillon) et 0 positif sur 3 pour les négatifs.
• Soixante-cinq laboratoires ont satisfait au critère. L'un a échoué au niveau bas, mais a démontré sa capacité avec des échantillons de niveau très bas et sa qualification est passée à performance modérée. Deux autres n'ont pas été évalués car le colis a mis 25 jours à arriver et la survie de la bactérie ne pouvait pas être garantie.

Ce dernier point est instructif : un mauvais résultat peut être dû à l'entité et non au laboratoire. Lors des deux tours menés en Inde mentionnés plus haut, environ 16 % des laboratoires de chaque tour ont obtenu des résultats insatisfaisants, presque tous en raison de faux positifs. Les auteurs ont désigné comme causes probables une reconstitution incorrecte de l'échantillon ou un délai insuffisant entre reconstitution et analyse, des erreurs opérationnelles, une contamination croisée et des défaillances dans l'identification ou la confirmation des colonies caractéristiques. Ce dernier point renvoie à ce qui est expliqué dans résultat présomptif vs. confirmé. En France, les laboratoires nationaux de référence ont organisé entre 2019 et 2021 un programme commun pour les laboratoires officiels, avec une moyenne de 65 participants par an.

Que faire face à un résultat discutable ou insatisfaisant

Le guide Eurachem est clair sur le principe : tout résultat insatisfaisant doit être investigué et documenté, et l'évaluation est enregistrée même si l'on décide de ne pas engager d'action. Un seul mauvais résultat ne prouve pas que le laboratoire est incompétent, mais une mauvaise performance répétée indique un problème sérieux, et le laboratoire devrait alors envisager de cesser de proposer cet essai jusqu'à sa résolution. L'investigation est gérée dans le cadre de la procédure de traitement des non-conformités du laboratoire. Un ordre pratique :

• Examiner le rapport. Confirmer que les résultats publiés sont bien ceux qui ont été envoyés et comprendre comment le score a été calculé.
• Écarter les erreurs administratives. Transcription, étiquetage, décimales ou unités. Si elles se répètent, le problème se situe dans le système de management, pas dans la technique.
• Examiner la partie technique. Stockage et reconstitution de l'entité, données de contrôle interne de la série, équipements, réactifs et étalonnage, conditions ambiantes et traitement des données. En microbiologie, cela inclut le contrôle des performances des milieux décrit dans contrôle qualité des milieux selon l'ISO 11133 et, si une PCR a été utilisée, les contrôles expliqués dans contrôles d'une PCR.
• Examiner le programme. Différences de matrice avec les échantillons de routine, détérioration de l'entité, niveaux hors du domaine de la méthode, valeur assignée ou σ_pt inadéquats, groupe de comparaison mal choisi ou erreurs de l'organisateur.
• Boucler le cycle. Analyser la cause à partir des données brutes, du tour complet, des tours précédents et du contrôle interne ; planifier l'action corrective, la mettre en œuvre et l'enregistrer, puis vérifier son efficacité, idéalement par une nouvelle participation.

Pour les résultats discutables, Eurachem suggère de définir quand les investiguer : par exemple, en cas de scores discutables répétés ou de résultats successifs présentant un biais de même signe.

Comment en tirer parti

L'entité doit être traitée comme un échantillon de routine : même méthode, même circuit et les analystes qui traitent les échantillons habituels. Il convient de choisir des programmes dont la matrice et le niveau ressemblent à la routine et de déclarer la méthode utilisée ; lors de l'essai européen de 2024, vingt laboratoires ont aussi rapporté les résultats d'une seconde méthode.

Quel lien entre les kits TAAG et les essais d'aptitude

TAAG n'organise pas d'essais d'aptitude et ne produit pas de matériaux pour ceux-ci. Mais un laboratoire qui utilise un kit TAAG en routine doit couvrir cette méthode dans son plan de participation. Deux exemples du catalogue sont Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97, PCR en temps réel avec sondes fluorescentes, conception Mila), avec une sensibilité déclarée de 1 UFC/25 g et comme matrices validées la cuisse de poulet crue, le steak haché de bœuf surgelé, la longanicilla, la mortadelle et les surfaces, et Specio 2.3 Listeria spp. and L. monocytogenes (V-SF04, PCR en temps réel avec courbe de fusion), avec une sensibilité déclarée de 1 UFC/25 g dans les aliments et comme matrices déclarées les aliments, les boissons et les surfaces vivantes et inertes. Les deux sont qualitatifs : un positif est présomptif jusqu'à sa confirmation. Le catalogue ne mentionne pas de certifications par des tiers pour ces kits ; un bon résultat à un essai d'aptitude démontre donc la performance du laboratoire avec cette méthode, mais ne remplace pas la validation par rapport à la méthode de référence qu'exige la série ISO 16140 pour l'utiliser à sa place. Si la matrice du programme ne figure pas parmi celles déclarées, il convient de confirmer la portée avec TAAG avant de participer.