Nombre le plus probable (NPP) : principe, lecture des tables et quand le préférer au dénombrement sur boîte

Compter sans voir de colonies

Le dénombrement sur boîte compte ce que l'on voit : chaque colonie sur la gélose est assimilée à une unité formant colonie, comme expliqué dans ce que sont les UFC et comment les interpréter. La méthode du nombre le plus probable (NPP, ou MPN selon le sigle anglais) aboutit à un chiffre par une autre voie. Elle ne compte pas de colonies : elle répartit l'échantillon dans plusieurs tubes de bouillon, observe lesquels présentent une croissance et, à partir de cette combinaison de positifs et de négatifs, calcule la concentration qui a le plus probablement produit ce résultat.

L'Annexe 2 du Bacteriological Analytical Manual (BAM) de la FDA attribue à McCrady, en 1915, la première estimation précise des bactéries viables par cette voie. La méthode reste d'actualité parce qu'elle règle des situations où la boîte échoue : faibles concentrations, aliments contenant des particules que l'on confond avec des colonies et micro-organismes qui ont besoin d'un enrichissement avant de pouvoir être isolés.

Le principe statistique

L'idée est de diluer jusqu'à ce que certains tubes reçoivent au moins une cellule viable et d'autres aucune. Si les bactéries sont réparties au hasard, le nombre de cellules qui tombe dans chaque tube suit une loi de Poisson, et la probabilité qu'un tube ne reçoive aucune cellule ne dépend que de la concentration et de la quantité d'échantillon inoculée. Avec plusieurs dilutions décimales et plusieurs tubes par dilution, la répartition des tubes positifs permet d'estimer la concentration d'origine. Le NPP est, littéralement, la valeur de concentration qui rend le résultat observé le plus probable ; l'équation se résout par itération.

Les hypothèses à respecter

Le BAM énumère quatre conditions pour que l'estimation soit valable :

• Les bactéries sont réparties au hasard dans l'échantillon.
• Elles sont séparées, non agrégées, et ne se repoussent pas entre elles.
• Tout tube qui reçoit ne serait-ce qu'un organisme viable produit une croissance ou un changement détectable.
• Les tubes sont indépendants les uns des autres.

La troisième hypothèse est la plus exigeante : le milieu doit permettre la croissance d'une seule cellule, parfois stressée, face à la flore annexe. C'est pourquoi la qualité du bouillon et de l'étape d'enrichissement conditionne directement le résultat. En outre, le NPP ne compte que les organismes viables. Si les bactéries forment des chaînes ou des amas que la dilution ne sépare pas, le BAM indique que le résultat doit être lu comme des unités de croissance ou des UFC, et non comme des cellules individuelles.

Séries de 3, 5 et 10 tubes

Le schéma le plus publié comporte trois dilutions décimales successives avec 3, 5, 8 ou 10 tubes chacune ; l'Annexe 2 contient des tables pour ces schémas, construites pour des inoculums de 0,1, 0,01 et 0,001 g. Le chapitre 4 du BAM, consacré aux coliformes et à E. coli, indique que la série à 3 tubes est utilisée pour la plupart des aliments ; que pour les mollusques bivalves il ne faut pas utiliser moins de 5 tubes par dilution ; et qu'il existe une méthode à 10 tubes pour l'eau embouteillée ou les échantillons dont on n'attend pas une forte contamination.

Plus de tubes signifie plus d'information par dilution et donc des intervalles plus étroits et une limite inférieure plus basse. Avec les tables du BAM et des inoculums de 0,1, 0,01 et 0,001 g, le résultat où tous les tubes sont négatifs est rendu comme inférieur à 3,0 NPP/g dans la série à 3 tubes et comme inférieur à 1,8 NPP/g dans celle à 5 tubes. La borne supérieure de l'intervalle de confiance de ce résultat nul descend de 9,5 à 6,8 et, avec 10 tubes, à 3,1 NPP/g.

Comment lire les tables

Le résultat s'exprime sous la forme d'un code à trois chiffres : le nombre de tubes positifs dans chacune des trois dilutions retenues. Dans la table à 3 tubes, le code 3-1-0 correspond à 43 NPP/g, avec un intervalle de confiance à 95 % de 9 à 180. Si les inoculums utilisés étaient dix fois plus petits que ceux de la table (0,01, 0,001 et 0,0001 g), la valeur et ses bornes sont multipliées par 10 : 430 NPP/g. La même règle vaut dans l'autre sens : inoculer des quantités plus importantes abaisse la limite de quantification.

Lorsque plus de trois dilutions sont ensemencées, le BAM décrit une procédure pour choisir les trois qui seront reportées dans la table. En résumé, on écarte les dilutions les plus élevées qui, avec la précédente, ont tous leurs tubes négatifs, et on recherche la dilution la plus élevée dont tous les tubes sont positifs. La FDA propose en outre une application de calcul et un tableur pour sélectionner les dilutions.

Les tables omettent les combinaisons si improbables qu'elles laissent supposer une erreur de laboratoire ou une contamination. Si le code obtenu ne figure pas dans la table, le BAM le traite comme un résultat improbable : il peut être dû à des interférences dans les dilutions basses ou à la confirmation d'un trop petit nombre de colonies, et si la cause n'est pas connue, l'estimation peut ne pas être fiable.

Intervalles de confiance : le chiffre s'accompagne d'une plage large

Un NPP doit toujours être lu avec son intervalle. Dans la série à 5 tubes, le code 5-2-0 donne 49 NPP/g avec un intervalle à 95 % de 15 à 150 : la valeur réelle peut se situer dans une plage qui couvre un facteur proche de dix. Le BAM définit cet intervalle ainsi : avant l'inoculation des tubes, la probabilité que l'intervalle obtenu contienne la concentration réelle est d'au moins 95 %. Les tables utilisent une modification de la méthode de de Man (1983) ; le tableur Excel de la FDA utilise une approximation normale du logarithme du NPP, de sorte que ses intervalles peuvent ne pas coïncider avec ceux des tables.

Plusieurs auteurs ont décrit la tendance du NPP à surestimer la concentration. Le BAM cite les travaux de Garthright (1993), qui a montré que ce biais n'est pas sensible lorsque les résultats sont exprimés en logarithmes, la forme habituelle pour comparer et combiner des données. Pour comprendre comment se combinent l'incertitude, la limite de détection et la décision de conformité, voir limite de détection et incertitude de mesure.

Où le NPP est utilisé dans l'industrie agroalimentaire

Coliformes et E. coli dans les aliments

La méthode classique du BAM comporte trois phases. Dans la phase présomptive, les dilutions sont ensemencées en bouillon lauryl sulfate tryptose (LST) et incubées à 35 °C ; on note la production de gaz à 24 et à 48 heures. Dans la phase de confirmation des coliformes, chaque tube présentant du gaz est repiqué en bouillon lactosé bilié au vert brillant (BGLB) à 35 °C, et pour les coliformes fécaux et E. coli, en bouillon EC à 44,5 °C. La phase complète pour E. coli ajoute un isolement sur gélose L-EMB et des tests biochimiques (IMViC). Le NPP est calculé à partir de la proportion de tubes confirmés dans trois dilutions successives. Le chapitre rappelle que coliforme n'est pas une catégorie taxonomique mais une définition opérationnelle. Ce qu'indique chaque groupe dans l'eau est expliqué dans coliformes totaux, E. coli et entérocoques.

E. coli dans les mollusques bivalves : ISO 16649-3

C'est le cas où le NPP est la méthode imposée par la norme. Le Règlement (CE) 2073/2005 établit pour les mollusques bivalves vivants, ainsi que pour les échinodermes, tuniciers et gastéropodes marins vivants, un critère de sécurité pour E. coli avec n = 5, c = 1, m = 230 et M = 700 NPP pour 100 g de chair et de liquide intervalvaire, pendant la durée de vie, avec l'EN/ISO 16649-3 comme méthode de référence. Le lot est satisfaisant si les cinq valeurs sont inférieures ou égales à 230, ou si une seule se situe entre 230 et 700.

Le protocole générique du Centre de référence de la FAO, fondé sur l'ISO 16649-3, décrit la méthode comme un NPP en deux étapes à 5 tubes et 3 dilutions. D'abord, l'homogénat de mollusque est ensemencé en bouillon minéral modifié au glutamate et incubé à 37 °C pendant 24 heures ; ensuite, les tubes présentant une production d'acide sont repiqués sur une gélose contenant un substrat chromogène de la β-glucuronidase (TBX) à 44 °C. La limite théorique de détection est de 18 E. coli pour 100 g, et avec trois dilutions le résultat maximal rendu est supérieur à 18 000. Les souches β-glucuronidase négatives, comme E. coli O157, ne sont pas détectées. Le même document signale que la norme Codex 292-2008 désigne cette méthode, ou une méthode équivalente, pour les mollusques bivalves vivants ou crus.

Salmonella quantitative sur les carcasses et la peau de cou

Pour Salmonella, la détection (absence dans 25 g) répond à la question de savoir si le pathogène est présent ; le NPP répond à la question de savoir combien il y en a. La spécification technique ISO/TS 6579-2:2012 décrit un NPP miniaturisé en plaques de 12 puits : trois puits par dilution, dilutions successives en eau peptonée tamponnée et repiquage sur milieu semi-solide MSRV à 41,5 °C, avec confirmation sur gélose XLD. La norme reconnaît sa limite : la limite de détection est d'environ 1 UFC/g, contre 1 UFC dans 25 g (0,04 UFC/g) pour la méthode de détection, et elle n'est pas adaptée aux échantillons contenant moins de 1 UFC/g, pour lesquels elle conseille un NPP conventionnel.

Une étude publiée dans Poultry Science en 2024 a appliqué ce NPP miniaturisé à 96 échantillons composites de peau de cou, représentant 480 carcasses de poulet. Elle a trouvé Salmonella dans 97,9 % des échantillons avant le refroidissement et dans 85,4 % après, avec des dénombrements moyens de 1,84 et 1,48 log NPP/g. Un résultat de présence n'aurait pas montré cette réduction. Ce type de quantification sert à évaluer les étapes du procédé, comme on le voit dans Salmonella dans la viande de poulet.

Listeria monocytogenes dans les échantillons positifs

Le chapitre 10 du BAM demande de dénombrer L. monocytogenes lorsqu'un aliment est positif, à partir d'une portion de réserve et en combinant NPP et ensemencement direct. Le NPP est réalisé avec 50 g d'échantillon dans 450 ml de bouillon d'enrichissement tamponné pour Listeria (BLEB) et quatre dilutions de trois tubes chacune, équivalant à 10, 1, 0,1 et 0,01 g d'échantillon. À 48 heures, chaque tube est ensemencé pour isolement et confirmation, ou criblé avec une méthode rapide approuvée, et les présomptifs sont confirmés ; le résultat est interprété avec les tables de l'Annexe 2. Si tous les tubes sont positifs, c'est le dénombrement par ensemencement direct qui fait foi.

NPP ou dénombrement sur boîte (UFC)

Ce ne sont pas des concurrents, mais des outils destinés à des gammes et à des matrices différentes :

• Sensibilité pour les faibles dénombrements. Le BAM souligne que le NPP est particulièrement utile pour les faibles concentrations, inférieures à 100 par gramme, notamment dans le lait et l'eau. Chaque tube peut recevoir plusieurs grammes, ce qui abaisse la limite inférieure.
• Matrices difficiles. Pour les aliments contenant des particules qui gênent le comptage des colonies, le tube de bouillon évite d'avoir à distinguer les colonies des débris alimentaires.
• Récupération des cellules stressées. Le bouillon joue le rôle d'une étape de croissance préalable, ce qui favorise les cellules stressées par la chaleur, le froid ou les désinfectants, à condition que le milieu soit adapté.
• Précision. C'est le point faible : les intervalles du NPP sont larges, si bien que deux résultats qui semblent différents peuvent ne pas différer statistiquement. Une boîte bien comptée dans sa plage utile est, en général, plus précise.
• Travail et délai. De nombreux tubes, plusieurs repiquages et des confirmations de 48 heures ou plus. La culture traditionnelle sur boîte est plus directe si la charge attendue est élevée.
• Confirmation. Dans les méthodes de recherche de pathogènes, un tube présentant une croissance est présomptif jusqu'à sa confirmation (voir résultat présomptif ou confirmé).

Quels kits TAAG se rapportent à cette méthode

TAAG ne propose pas de kit NPP : ses kits de PCR en temps réel sont qualitatifs (détection et identification) et ne fournissent pas un nombre de micro-organismes par gramme. Ils peuvent jouer un rôle dans la lecture des tubes ou des puits, comme l'admet le chapitre 10 du BAM pour le NPP de Listeria. Le catalogue comprend des kits pour les micro-organismes que l'on quantifie par NPP : Specio 1.3 E. coli (V-SF167), avec des matrices déclarées d'aliments, de boissons et de surfaces vivantes et inertes ; Ampliora 1.3 E. coli (V-SF69), pour les légumes-feuilles et les surfaces ; Ampliora 1.1 Salmonella spp. (V-SF97), avec une sensibilité déclarée de 1 UFC/25 g dans la cuisse de poulet crue, le steak haché de bœuf surgelé, la saucisse (longanicilla), la mortadelle et les surfaces ; et Ampliora 2.3 Listeria spp. and L. monocytogenes (V-SF46), pour les aliments, les boissons et les surfaces. Aucun ne déclare les mollusques bivalves comme matrice validée, et leurs milieux d'enrichissement associés ne sont pas les bouillons d'un NPP normalisé (MMGM, BLEB ou MSRV). Utiliser un kit pour lire les tubes d'un NPP impose de valider cet usage avec le bouillon et la matrice concernés ; il est conseillé d'en discuter avec TAAG avant de l'intégrer à une procédure.