מבחני מיומנות והשוואות בין-מעבדתיות במיקרוביולוגיה של מזון: מה התקנים דורשים וכיצד קוראים z-score

מהו מבחן מיומנות ובמה הוא שונה מהשוואות אחרות

מעבדה עם שיטות מתוקפות ואנליסטים מיומנים עלולה לגרור הטיה שאיש אינו מזהה מבפנים. הדרך לראות אותה היא להשוות את תוצאותיה לאלה של מעבדות אחרות המנתחות את אותו חומר. ISO/IEC 17043:2023 מגדיר השוואה בין-מעבדתית כארגון, ביצוע והערכה של מדידות או בדיקות על פריטים זהים או דומים על ידי שתי מעבדות או יותר, בתנאים שנקבעו מראש. מבחן מיומנות (באנגלית, proficiency testing או PT) הוא מקרה פרטי: הוא מעריך את הביצועים של כל משתתף מול קריטריונים שנקבעו מראש, באמצעות השוואה בין-מעבדתית.

לא כל השוואה מעריכה את המעבדה. מחקר בין-מעבדתי לקביעת מאפייני הביצוע של שיטה, כמו אלה של סדרת ISO 16140 המתוארת בתיקוף ואימות של שיטות מיקרוביולוגיות, מודד את השיטה ולא את המשתתף.

מה ISO/IEC 17025 דורש

סעיף 7.7 של ISO/IEC 17025:2017 דורש נוהל להבטחת תקפות התוצאות. סעיף 7.7.1 מרכז את האמצעים הפנימיים (חומרי ייחוס, בקרות, חזרות, השוואה בין אנליסטים), ו-7.7.2 מוסיף את המבט החיצוני: על המעבדה לעקוב אחר הביצועים שלה בהשוואה לתוצאות של מעבדות אחרות, באמצעות מבחני מיומנות או השוואות בין-מעבדתיות אחרות, כשהן זמינות ומתאימות. המסגרת הכללית של ההסמכה נמצאת בהסמכת ISO/IEC 17025 במעבדות מזון.

המדיניות ILAC-P9:01/2024, שמיישמים גופי ההסמכה החתומים על הסדר ההכרה ההדדית של ILAC, מתרגמת דרישה זו לכללים קונקרטיים:

• ההשתתפות נחשבת חובה כשמבחן המיומנות זמין, מתאים ונחשב נחוץ לפי ניתוח הסיכונים של המעבדה.
• למעבדה צריכה להיות תוכנית השתתפות, וגוף ההסמכה מעריך אותה לפני מתן ההסמכה כדי לוודא שהיא מכסה את התחולה באופן מייצג.
• כשהביצועים אינם מספקים, הגוף מעריך את הראיות לפעולות מתקנות מהירות ומתאימות.

רמת ההשתתפות ותדירותה

איש אינו משתתף במבחן לכל צירוף של שיטה, אנליט ומטריצה. ILAC-P9, בעקבות ההנחיה EA-4/18 G:2021, מציע לקבץ את התחולה לתחומי מומחיות טכנית: צירופים של טכניקה, מאפיין ומוצר השקולים דיים כך שהתוצאה של אחד מייצגת את האחרים. טכניקות שונות כמעט אף פעם אינן נכנסות לאותו תחום; מוצרים שונים כן, אם המטריצות בעלות אופי שקול. את התדירות המינימלית לכל תחום קובעת המעבדה לפי הסיכון: נפח הניתוחים, תחלופת הצוות וניסיונו, יציבות האנליט והמטריצה, חסינות השיטה והשימוש הסופי בנתון. ההנחיה מציינת את בטיחות המזון בין התחומים הדורשים רמת הבטחה גבוהה.

שלושת התקנים שעליהם נשען מבחן מיומנות במיקרוביולוגיה

ISO/IEC 17043:2023: הכשירות של הספק

הוא קובע את דרישות הכשירות והאי-תלות של ספקי מבחני מיומנות. המהדורה השנייה, ממאי 2023, החליפה את זו של 2010, שלפי ILAC-P9 נשארה תקפה עד מאי 2026. עבור המשתתף, השאלה המעשית היא אם הספק מוסמך לפי תקן זה על ידי גוף החתום על הסדר ILAC, שזו הדרך המוכרת להוכיח את כשירותו.

ISO 13528:2022: הסטטיסטיקה

הוא מתאר את השיטות הסטטיסטיות לתכנון התוכניות ולניתוח הנתונים שלהן, ונותן המלצות לפירוש התוצאות, הן הכמותיות והן האיכותניות. המהדורה השלישית היא מאוגוסט 2022 ויש לה תיקון שפורסם ב-2026. כאן נמצאות השיטות לקביעת הערך המוקצה (ערך הייחוס של הסבב), סטיית התקן להערכת המיומנות (σ_pt, הקובעת כמה נסבל) וציוני הביצוע.

ISO 22117:2019: הייחודי למיקרוביולוגיה

הוא החליף את המפרט הטכני ISO/TS 22117:2010 ואושר מחדש בסקירה התקופתית שלו. הוא קובע דרישות והכוונה לארגון תוכניות מבחני מיומנות במיקרוביולוגיה של מזון ומשקאות, מזון לבעלי חיים, דגימות סביבתיות מייצור ומטיפול במזון ובמזון לבעלי חיים, וייצור ראשוני; וגם של מים המשמשים בייצור מזון או הנחשבים מזון לפי החקיקה הלאומית. הוא מכסה את הארגון הטכני של התוכנית ואת הטיפול הסטטיסטי בתוצאות, ומיועד לשימוש יחד עם ISO/IEC 17043 ו-ISO 13528: הוא מוסיף רק את מה שהמיקרוביולוגיה צריכה בנוסף. דוגמה לכך היא הכנת החומר: תוכנית משנת 2021 בהודו ל-Listeria monocytogenes ול-Salmonella בשרימפס מיובש בהקפאה בדקה את ההומוגניות ואת היציבות של הפריט במהלך האחסון (עד 28 ימים) וההובלה (עד 6 ימים) לפני שליחתו.

כיצד קוראים z-score

הציון הנפוץ ביותר הוא z-score: z = (x_i − x_pt) / σ_pt, כאשר x_i היא תוצאת המעבדה, x_pt הערך המוקצה ו-σ_pt הסטייה להערכה. הפירוש המקובל, הלקוח מ-ISO 13528 ומובא בהנחיה של Eurachem משנת 2021, הוא:

• |z| ≤ 2.0: ביצועים מספקים, ללא אות.
• 2.0 < |z| < 3.0: ביצועים מוטלים בספק, אות אזהרה.
• |z| ≥ 3.0: ביצועים לא מספקים, אות לפעולה.

דוגמה להמחשה: אם הערך המוקצה של ספירה הוא 4.20 log CFU/g, ‏σ_pt הוא 0.25 log והמעבדה מדווחת 4.85 log CFU/g, אז z = 0.65 / 0.25 = 2.6: מוטל בספק. מה מייצגת CFU וכיצד מפרשים ספירה מוסבר במהן יחידות CFU.

שתי אזהרות. ראשית, ה-z-score תלוי ב-σ_pt: ככל שהוא גדול יותר, z קטן יותר והביצועים נראים טובים יותר, ולכן כדאי לבדוק אם לערך זה יש היגיון לשימוש שהמעבדה עושה בתוצאותיה. שנית, ה-z-score אינו מביא בחשבון את אי-הוודאות של הערך המוקצה. אם אי-הוודאות התקנית הזו קטנה מ-0.3·σ_pt, היא נחשבת זניחה; אם לא, על הספק להשתמש בדרך אחרת לקביעת הערך המוקצה, בציונים המשלבים אותה, כמו z′ או zeta (ζ), או להודיע למשתתפים. הקשר בין ציונים אלה לאי-הוודאות של המעבדה עצמה נדון בגבול גילוי ואי-ודאות מדידה.

בדיקות איכותניות: כשהתוצאה היא זוהה או לא זוהה

רוב ניתוחי הפתוגנים הם של נוכחות או היעדר, ושם אין טעם לחשב ממוצעים או סטיות. ISO 13528 מאפשר לקבוע את הערך המוקצה לפי ההכנה הידועה של הפריט, לפי חומרי ייחוס או לפי שיפוט מומחה, והביצועים מוערכים לפי קריטריונים של תוצאות נכונות בדגימות חיוביות ושליליות. המבחן משנת 2024 של מעבדת הייחוס של האיחוד האירופי ל-Salmonella, שתכנונו הכללי מבוסס על ISO 22117, מראה כיצד עושים זאת:

• השתתפו 68 מעבדות ייחוס לאומיות, שניתחו לפי EN ISO 6579-1 מטושי בד שזוהמו ב-S. Typhimurium ברמות שונות ודגימות לא מזוהמות.
• קריטריון הביצועים הטובים דרש לפחות 2 מתוך 3 חיוביים ברמה הגבוהה (37.5 CFU לדגימה), לפחות 2 מתוך 4 ברמה הנמוכה (4.5 CFU לדגימה) ו-0 מתוך 3 חיוביים בדגימות השליליות.
• שישים וחמש מעבדות עמדו בקריטריון. אחת נכשלה ברמה הנמוכה, אך הוכיחה את יכולתה בדגימות ברמה נמוכה במיוחד, והדירוג שלה עבר לביצועים בינוניים. שתיים אחרות לא הוערכו משום שהחבילה הגיעה אחרי 25 ימים ולא ניתן היה להבטיח את הישרדות החיידק.

הנקודה האחרונה מלמדת דבר מה: תוצאה גרועה יכולה לנבוע מהפריט ולא מהמעבדה. בשני הסבבים בהודו שהוזכרו, כ-16% מהמעבדות בכל סבב קיבלו תוצאות לא מספקות, כמעט כולן בשל תוצאות חיוביות כוזבות. המחברים הצביעו כגורמים סבירים על שחזור לא נכון של הדגימה או זמן לא מספיק בין השחזור לניתוח, טעויות תפעוליות, זיהום צולב וכשלים בזיהוי או באישור של מושבות אופייניות. הגורם האחרון מתחבר למה שמוסבר בתוצאה משוערת מול תוצאה מאושרת. בצרפת, מעבדות הייחוס הלאומיות ארגנו בין 2019 ל-2021 תוכנית משותפת למעבדות הרשמיות, עם ממוצע של 65 משתתפים בשנה.

מה עושים מול תוצאה מוטלת בספק או לא מספקת

ההנחיה של Eurachem ברורה בעיקרון: יש לחקור ולתעד כל תוצאה לא מספקת, וההערכה נרשמת גם אם מחליטים לא לנקוט פעולות. תוצאה גרועה אחת אינה מוכיחה שהמעבדה אינה כשירה, אבל ביצועים גרועים חוזרים מצביעים על בעיה רצינית, ואז על המעבדה לשקול להפסיק להציע את הבדיקה הזו עד שהבעיה תיפתר. החקירה מנוהלת במסגרת נוהל אי-ההתאמות של המעבדה. סדר מעשי:

• לבדוק את הדוח. לוודא שהתוצאות שפורסמו הן אלה שנשלחו ולהבין כיצד חושב הציון.
• לשלול טעויות מנהליות. העתקה, סימון, ספרות עשרוניות או יחידות. אם הן חוזרות, הבעיה היא במערכת הניהול, לא בטכניקה.
• לבדוק את החלק הטכני. אחסון ושחזור הפריט, נתוני הבקרה הפנימית של הריצה, ציוד, ריאגנטים וכיול, תנאי סביבה ועיבוד נתונים. במיקרוביולוגיה, זה כולל את בקרת הביצועים של המצעים המתוארת בבקרת איכות של מצעי גידול לפי ISO 11133 וכן, אם נעשה שימוש ב-PCR, את הבקרות המוסברות בבקרות של PCR.
• לבדוק את התוכנית. הבדלי מטריצה מול דגימות השגרה, התדרדרות הפריט, רמות מחוץ לטווח השיטה, ערך מוקצה או σ_pt לא מתאימים, קבוצת השוואה שנבחרה שלא כראוי או טעויות של הספק.
• לסגור את המעגל. לנתח את הגורם עם הנתונים הגולמיים, הסבב המלא, הסבבים הקודמים והבקרה הפנימית; לתכנן את הפעולה המתקנת, לבצע ולתעד אותה, ולאמת את יעילותה, רצוי בהשתתפות חדשה.

לתוצאות המוטלות בספק, Eurachem מציעה להגדיר מתי לחקור אותן: למשל, מול ציונים מוטלים בספק חוזרים או תוצאות רצופות עם אותו סימן של הטיה.

כיצד להפיק מכך תועלת

יש לטפל בפריט כבדגימת שגרה: אותה שיטה, אותו תהליך עבודה ואותם אנליסטים המעבדים את הדגימות הרגילות. כדאי לבחור תוכניות שהמטריצה והרמה שלהן דומות לשגרה ולדווח על השיטה שבה נעשה שימוש; במבחן האירופי של 2024, עשרים מעבדות דיווחו גם על התוצאות של שיטה שנייה.

מה הקשר בין הערכות של TAAG למבחני מיומנות

TAAG אינה מארגנת מבחני מיומנות ואינה מייצרת חומרים עבורם. אבל מעבדה המשתמשת בערכה של TAAG בשגרה צריכה לכסות שיטה זו בתוכנית ההשתתפות שלה. שתי דוגמאות מהקטלוג הן Ampliora 1.1 Salmonella spp. ‏(V-SF97, PCR בזמן אמת עם בדיקנים פלואורסצנטיים, תכנון עם Mila), עם רגישות מוצהרת של 1 CFU/25 g ומטריצות מתוקפות של ירך עוף גולמית, המבורגר בקר קפוא, נקניק לונגניסה דק, מורטדלה ומשטח, ו-Specio 2.3 Listeria spp. and L. monocytogenes ‏(V-SF04, PCR בזמן אמת עם עקומת היתוך), עם רגישות מוצהרת של 1 CFU/25 g במזון ומטריצות מוצהרות של מזונות, משקאות ומשטחים חיים ואינרטיים. שתיהן איכותניות: תוצאה חיובית היא משוערת עד שהיא מאושרת. הקטלוג אינו רושם הסמכות של צד שלישי לערכות אלה, ולכן תוצאה טובה במבחן מיומנות מוכיחה את ביצועי המעבדה עם שיטה זו, אבל אינה מחליפה את התיקוף מול שיטת הייחוס שסדרת ISO 16140 דורשת כדי להשתמש בה במקומה. אם המטריצה של התוכנית אינה בין המוצהרות, כדאי לאשר את התחולה עם TAAG לפני ההשתתפות.