חלק מעמוד התווך של יסודות ותקינה במרכז הלמידה של TAAG. מרחיב נקודה שהזכרנו בהסמכה לפי ISO/IEC 17025 ונשען על הגידול המיקרוביולוגי המסורתי.
תוכן העניינים
גם מצע הגידול נבדק
כאשר מעבדה מדווחת "Salmonella: לא זוהתה" או על ספירת Enterobacteriaceae, היא מניחה שהמצע שעליו הוזרעה הדגימה פעל כראוי. אם אצווה של אגר סלקטיבי מעכבת גם את המיקרואורגניזם המבוקש, או מאפשרת לפלורה הנלווית שהיה עליה לדכא לגדול, התוצאה שגויה גם אם האנליסט עשה הכול כהלכה. לכן במיקרוביולוגיה של מזון קיים תקן המוקדש אך ורק למצעים: ISO 11133.
ההקדמה לתקן מסכמת את המטרה בשלושה רעיונות: להוכיח שכל אצווה של מצע מתאימה, שהמצע מתאים לשימוש המיועד ושהוא מפיק תוצאות עקביות. אלה, כלשון התקן עצמו, חלק מהותי מבקרת האיכות הפנימית של המעבדה.
מהו ISO 11133 ועל מי הוא חל
המהדורה התקפה, ISO 11133:2014, החליפה את המפרטים הטכניים ISO/TS 11133-1:2009 ו-ISO/TS 11133-2:2003 וצירפה את המצעים לבדיקות מים. התקן מגדיר את מונחי הבטחת האיכות של מצעים, קובע דרישות להכנתם ומתאר שיטות וקריטריונים להערכת הביצועים שלהם. הוא מכסה את המצעים המשמשים לבדיקת מזון, מזון לבעלי חיים, דגימות מסביבת הייצור ומים לשתייה או לשימוש בייצור מזון.
הוא חל על יצרנים ומפיצים של מצעים מיובשים או מוכנים לשימוש, על גופים לא מסחריים המספקים אותם לאחרים ועל מעבדות המכינות מצעים בעצמן. תיקון 1 משנת 2018 הוסיף במפורש את משתמשי הקצה של מצעים מוכנים לשימוש: רכישת צלחות מוכנות אינה פוטרת את המעבדה מבקרתן.
שני תיקונים ומהדורה חדשה בדרך
- תיקון 1 (2018): תיקונים והבהרות, ובהם רמות החיסון לבדיקות ביצוע.
- תיקון 2 (2020): הוסיף את נספח K, עם זני הביקורת למצעים ולריאגנטים לאישור ולאפיון.
- מהדורה שנייה: הטיוטה ISO/FDIS 11133, שתשנה את שמה ל"מצעי גידול וריאגנטים", נמצאת בשלב ההצבעה האחרון ב-ISO ותחליף את מהדורת 2014 עם פרסומה.
הוועדה ISO/TC 34/SC 9 מבהירה גם כי תקנים לפי מיקרואורגניזם שפורסמו אחרי 2014 וכוללים סעיף משלהם לבדיקות ביצוע גוברים על האמור ב-ISO 11133:2014 לגבי אותם מצעים.
שלוש התכונות הנבדקות
פרודוקטיביות
זוהי רמת ההתאוששות של מיקרואורגניזם המטרה במצע בתנאים מוגדרים. היא עונה על השאלה הבסיסית ביותר: אם המיקרואורגניזם נמצא, האם המצע מאפשר לו לגדול?
סלקטיביות
זוהי מידת העיכוב של מיקרואורגניזם שאינו מטרה במצע סלקטיבי. אגר לSalmonella שמאפשר ל-Escherichia coli לגדול באין מפריע מפיק צלחות רוויות שבהן המושבות האופייניות אובדות.
ספציפיות (אלקטיביות)
זוהי ההוכחה שמיקרואורגניזמים שאינם מטרה, אם הם בכל זאת גדלים, אינם מציגים את אותם מאפיינים חזותיים כמו המטרה: הצבע, ההילה או המורפולוגיה שבהם משתמש האנליסט כדי לזהות מושבה חשודה. במצעים כרומוגניים זוהי התכונה המונעת בלבול בין מושבה אחת לאחרת.
כיצד בודקים אותם
בדיקה כמותית ויחס פרודוקטיביות
במצעים מוצקים לספירה, התקן משווה את הגידול במצע הנבדק לגידול במצע ייחוס, בדרך כלל לא סלקטיבי, כמו אגר טריפטון סויה (TSA). התוצאה היא יחס הפרודוקטיביות, PR = NS/N0: הספירה במצע הנבדק חלקי הספירה במצע הייחוס. תיקון 1 קובע חיסון של כ-100 CFU כדי להשיג דיוק מספק, עם טווח מעשי של 80 עד 120 CFU לצלחת ומינימום של 50.
הקריטריון המקובל הוא PR של לפחות 0.5 למצעים סלקטיביים ולפחות 0.7 למצעים לא סלקטיביים. דוגמה קונקרטית מהתקן: אגר TBX ל-E. coli חיובי ל-β-גלוקורונידאז נבדק בעזרת זני E. coli, מושווה ל-TSA וצריך להניב PR ≥ 0.5 עם מושבות כחולות.
בדיקות איכותניות
במצעים נוזליים ובחלק מהמצעים המוצקים התוצאה מתבטאת בסולם פשוט: 0 (ללא גידול או ללא עכירות), 1 (גידול חלש) ו-2 (גידול טוב). לבדיקת הסלקטיביות, תיקון 1 דורש לחסן לפחות 104 CFU של המיקרואורגניזם שאינו מטרה; לבדיקת הספציפיות בצלחות, לפחות 103 CFU.
מרקי העשרה סלקטיביים
מרקים כמו RVS ל-Salmonella נבדקים בחיסון המטרה, שאינו המטרה או תערובת של שניהם, ולאחר מכן בהזרעה בפסים על מצע בידוד (למשל XLD) ועל מצע לא סלקטיבי. סלקטיביות המרק נחשבת משביעת רצון אם בצלחת הלא סלקטיבית אין גידול של שאינו המטרה, או שיש פחות מ-10 או פחות מ-100 CFU, בהתאם לנספח הרלוונטי או לתקן הספציפי. זהו אותו עיקרון שמכריע את הצלחת ההעשרה המיקרוביולוגית בדגימה אמיתית.
מצעים רב-תכליתיים ומצעי אישור
במצע בעל שימושים מרובים, כמו מי פפטון מבוקרי pH (BPW), תיקון 1 מבקש לפחות בדיקת העשרה מקדימה אחת עם פתוגן רלוונטי למעבדה, למשל Salmonella. במצעים ובריאגנטים לאישור (נספח K) הבדיקה איכותנית משום שמתחילים ממושבה מבודדת: ביקורת החיוב נדגרת את הזמן המינימלי שמותר לפי התקן וביקורת השלילה את המקסימלי. כך מוודאים שהחיובית מופיעה בזמן ושהשלילית אינה משנה צבע בשל דגירה ממושכת מדי. אישור מושבות חשודות מוסבר במאמר על תוצאה משוערת ותוצאה מאושרת.
זני ביקורת: מדוע מספר ה-WDCM חשוב
בדיקת ביצוע ניתנת להשוואה בין מעבדות רק אם כולן משתמשות בזנים שווי ערך. ISO 11133 מגדיר שרשרת מדויקת:
- זן ייחוס: מתקבל ישירות מאוסף החבר בפדרציה העולמית לאוספי תרביות (WFCC) או בארגון האירופי ECCO, ומזוהה לפחות ברמת הסוג והמין.
- מלאי ייחוס: תרביות זהות המתקבלות בהעברה אחת של זן הייחוס.
- תרבית מלאי: העברה ראשונית של מלאי הייחוס.
- תרבית עבודה: זו המשמשת בבדיקה, המתקבלת ממלאי הייחוס, מתרבית המלאי או מחומר ייחוס.
כל אוסף ממספר את זניו בדרכו, ולכן לאותו זן יש קודים שונים בכל קטלוג. המרכז העולמי לנתוני מיקרואורגניזמים (WDCM) פתר את הבעיה באמצעות מזהה ייחודי: קטלוג זני הייחוס של WDCM. לדוגמה, WDCM 00031 מתאים ל-Salmonella Typhimurium NCTC 12023 באוסף הבריטי.
דוגמה מהרשימה הרשמית
הוועדה ISO/TC 34/SC 9 מפרסמת רשימה של זני ביקורת לכל מצע וריאגנט בתקניה; המהדורה הרביעית היא ממאי 2025. עבור אגר XLD לפי ISO 6579-1, הרשימה מציינת Salmonella Enteritidis WDCM 00030 או Typhimurium WDCM 00031, E. coli WDCM 00012 או 00013 ו-Enterococcus faecalis WDCM 00009 או 00087. הערה מזהירה שחלק מהרגולציות הלאומיות עשויות לדרוש סרוטיפ אחר של Salmonella, והערה נוספת מסמנת באות "b" את הזנים שחובה להשתמש בהם לכל הפחות.
מעבר לבדיקה המיקרוביולוגית
בקרת מצע מתחילה לפני ההזרעה. ISO 11133 דורש מהיצרן לתעד, בין היתר, את שם המצע ורכיביו, את הגיליון הטכני, את מספר האצווה, את ה-pH היעד של המצע המוכן, את תנאי האחסון ואת תאריך התפוגה. מעבדה המכינה מצעים בעצמה צריכה לשים לב גם למים, לשקילה, לעיקור, ל-pH הסופי ולאחסון; ISO 7218:2024 משלים את הדרישות הכלליות האלה למעבדה המיקרוביולוגית.
כל זה משתלב ב-ISO/IEC 17025, המחייב להבטיח את התאמתם של מוצרים שמסופקים מבחוץ ולפקח על תקפות התוצאות. אצווה שנכשלת בבקרה היא עבודה שאינה תואמת: יש להעריך אילו בדיקות עשויות היו להיפגע, כפי שמוסבר במאמר על הסמכה לפי ISO/IEC 17025. בשיטות מולקולריות ההיגיון זהה, עם בקרות משלהן, המוסברות במאמר על בקרות ב-PCR.
טעויות נפוצות
- קבלת תעודת הספק כבקרה יחידה, בלי לאמת את האצווה במעבדה.
- שימוש בזני אוסף שהועברו שוב ושוב ללא רישום, ללא יכולת לעקוב אחר מקורם עד זן הייחוס.
- בדיקת פרודוקטיביות עם חיסונים גבוהים מאוד, המסתירים עיכוב חלקי של המצע.
- בקרת הפרודוקטיביות תוך שכחת הסלקטיביות או הספציפיות במצעים סלקטיביים וכרומוגניים.
- התעלמות מכך שהתקן הספציפי למיקרואורגניזם עשוי לקבוע זנים וקריטריונים משלו הגוברים על ISO 11133.
סיכום
מצע גידול הוא ריאגנט בעל ביצועים הניתנים למדידה, ולא חומר נייטרלי. ISO 11133 מסדיר כיצד להוכיח זאת: פרודוקטיביות מול מצע ייחוס, סלקטיביות עם חיסונים גבוהים של מי שאינו המטרה, ספציפיות במצעים המבחינים וזני ביקורת הניתנים למעקב באמצעות מספרי WDCM. בקרה של כל אצווה, רישום שרשרת ההעברות והבדיקה של מה שהתקן של כל מיקרואורגניזם דורש מונעים מצב שבו תוצאה תלויה באצווה פגומה בלי שאיש יודע על כך.
על TAAG
גלו כיצד TAAG משלימה את עבודת מעבדת הגידול בערכות זיהוי מולקולריות הכוללות בקרות תגובה משלהן.
שאלות נפוצות
מהו ISO 11133?
זהו התקן הבינלאומי המגדיר כיצד להכין, לייצר, לאחסן ולבקר את ביצועי מצעי הגידול המשמשים במיקרוביולוגיה של מזון, מזון לבעלי חיים, סביבת ייצור ומים. המהדורה התקפה היא משנת 2014, עם תיקונים מ-2018 ומ-2020.
מה ההבדל בין פרודוקטיביות, סלקטיביות וספציפיות של מצע?
הפרודוקטיביות מודדת כמה מיקרואורגניזם המטרה המצע משחזר. הסלקטיביות מודדת עד כמה הוא מעכב את אלה שאינם המטרה. הספציפיות מוכיחה שאלה שאינם המטרה וגדלים אינם מתבלבלים חזותית עם המטרה.
מהו מספר WDCM?
זהו מזהה ייחודי שהמרכז העולמי לנתוני מיקרואורגניזמים מקצה לזנים המומלצים לבקרת איכות. הוא מאפשר לדעת שזנים בעלי קודים שונים באוספים שונים הם למעשה אותו זן.
האם מעבדה הרוכשת צלחות מוכנות לשימוש צריכה לבקר אותן?
כן. תיקון 1 משנת 2018 כלל במפורש את משתמשי הקצה של מצעים מוכנים לשימוש בתחולת ISO 11133, ו-ISO/IEC 17025 דורש לאמת את התאמתם של חומרי גלם המסופקים מבחוץ.