MALDI-TOF במיקרוביולוגיה של מזון: כיצד מזהים בידוד בתוך דקות

צוואר הבקבוק של הזיהוי

במעבדת מזון, איתור מושבה חשודה הוא רק חצי מהעבודה. החצי השני הוא לדעת מה היא. במשך עשרות שנים נענתה השאלה הזו בסדרות של בדיקות ביוכימיות, בערכות מסחריות ובסרולוגיה, שיכולות לדרוש יום או יומיים נוספים לכל בידוד. ספקטרומטריית המסות MALDI-TOF שינתה את השלב הזה בניתוח: ממושבה טהורה היא מספקת זיהוי בתוך דקות.

מאמר זה מסביר כיצד הטכניקה פועלת, היכן היא משתלבת בזרימת העבודה של מעבדת מזון, כיצד מאמתים אותה לאישור פתוגנים ואילו שאלות היא אינה יכולה לענות עליהן.

מה פירוש MALDI-TOF

ראשי התיבות מתארים את שני חלקי התהליך. MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) היא הדרך להפוך את מולקולות הדגימה ליונים: החומר המיקרוביאלי מעורבב עם מטריצה כימית הסופגת את האנרגיה של לייזר ומעבירה אותה לחלבונים, שנפרדים ונשארים טעונים. TOF (time of flight) היא הדרך למדוד אותם: היונים מואצים בצינור ואקום ומגיעים לגלאי בזמן התלוי ביחס שלהם בין מסה למטען. הקלים יותר מגיעים קודם.

התוצאה היא ספקטרום: סדרת פסגות הפועלת כטביעת אצבע של חלבונים. לפי הסקירה של Singhal ושותפיו (2015), הזיהוי מבוסס על הדפוס של חלבונים ריבוזומליים שופעים מאוד, בטווח של 2 עד 20 kDa. מכיוון שחלבונים אלה משתנים מעט בתוך מין ושונים בין מינים, הפרופיל מאפשר לזהות את המיקרואורגניזם.

כיצד נראית זרימת העבודה במעבדה

1. להתחיל ממושבה טהורה

MALDI-TOF אינו עובד על המזון ואינו עובד על מרק ההעשרה. הוא זקוק לבידוד: מושבה שגדלה בצלחת, רצוי מופרדת ממושבות אחרות. Singhal ושותפיו מציינים שהטכניקה אינה יכולה לזהות אורגניזמים ישירות מאוכלוסיות מעורבות. לכן MALDI-TOF בא אחרי הגידול בצלחת, לא במקומו.

2. להכין את הדגימה

יש שלוש רמות הכנה, הנבחרות לפי סוג המיקרואורגניזם:

• העברה ישירה: מורחים מנה מזערית של המושבה על הלוח המתכתי של המכשיר ומכסים במטריצה. Singhal ושותפיו מציינים שזה עובד היטב עבור חיידקים גרם-שליליים רבים.
• העברה ישירה עם חומצה פורמית: מוסיפים טיפת חומצה פורמית לפני המטריצה כדי לסייע בפירוק דפנות תאים עמידות יותר. לפי אותה סקירה, היא משפרת את זיהוי החיידקים הגרם-חיוביים והפטריות.
• מיצוי מלא: פרוטוקול עם אתנול וחומצה פורמית המשחרר את החלבונים לפני הנחתם. מיקרואורגניזמים כמו מיקובקטריות דורשים נהלים ייחודיים נוספים.

3. לרכוש את הספקטרום ולהשוות אותו

המכשיר מפיק את הספקטרום והתוכנה משווה אותו למאגר של ספקטרומי ייחוס. התוצאה היא זיהוי מלווה בציון התאמה; כל מערכת מגדירה את טווחי הציון שהיא רואה כאמינים ברמת הסוג או המין. ציון נמוך אינו זיהוי, ונוהל המעבדה צריך לומר מה לעשות במקרה כזה: לחזור עם מיצוי, להעביר מחדש או לפנות לשיטה אחרת.

גיל התרבית חשוב

פרט שלעיתים מתעלמים ממנו הוא שפרופיל החלבונים משתנה עם המצב הפיזיולוגי של התא. Janiszewska ושותפיה (2023) חקרו את זיהוי מיני Bacillus יוצרי נבגים שבודדו מחלב פרה, מכרוב כבוש ומחמוצים. הם מצאו שזמן הדגירה האופטימלי נע בין 1 ל-12 שעות בהתאם לזן, עם נוכחות נמוכה יותר של נבגים בין השעה החמישית לשמינית, ושלאחר 24 שעות דגירה רק כ-47% מהדגימות זוהו בהצלחה. במחקר זה, ההעברה הישירה והמיצוי הניבו תוצאות דומות.

הלקח המעשי הוא שעבור מיקרואורגניזמים יוצרי נבגים, צלחת "ישנה" יכולה להניב ציונים נמוכים גם אם המכשיר והמאגר פועלים היטב. זה רלוונטי בעבודה עם Bacillus cereus או עם Alicyclobacillus, שניהם יוצרי נבגים.

MALDI-TOF כשיטת אישור

במיקרוביולוגיה של מזון, השימוש הרגולטורי החשוב ביותר של MALDI-TOF הוא אישור בידודים משוערים של פתוגנים. כדי שמעבדה תוכל להשתמש בו למטרה זו, השיטה צריכה להיות מאומתת.

שיטת AOAC 2017.09

שיטת AOAC 2017.09 הרשמית, המבוססת על מערכת MALDI-TOF מסחרית, מכסה את אישור וזיהוי Salmonella spp., Cronobacter spp. וגרם-שליליים אחרים מאגרים סלקטיביים ולא סלקטיביים, והורחבה לאחר מכן ל-Campylobacter. המחקר השיתופי שפורסם ב-Journal of AOAC International (2019) כלל, עבור Salmonella, 15 משתתפים מ-15 מעבדות שירות באירופה. המחברים מדווחים על 100% זיהויים נכונים ברמת הסוג עבור Salmonella ו-Cronobacter מכל סוג אגר, ותוצאות שוות ערך לנהלי האישור שנקבעו בכל שיטת ייחוס.

ה-BAM של ה-FDA

פרק 5 במדריך האנליטי הבקטריולוגי (BAM) של ה-FDA מקבל את הזיהוי באמצעות MALDI-TOF לפי AOAC OMA 2017.09 כאחד המסלולים לאישור בידודים משוערים של Salmonella, לצד השילוב של סרולוגיה וביוכימיה ושיטות מכשיריות מאומתות אחרות. אנו מפרטים זאת בתוצאה משוערת מול תוצאה מאושרת.

ISO 16140-6 ו-ISO 16140-3

במסגרת ISO, אימות שיטות חלופיות לאישור ולטיפוס מכוסה על ידי ISO 16140-6:2019. וכמו בכל שיטה מאומתת, כל מעבדה צריכה להוכיח שהיא מיישמת אותה כראוי בתנאיה. לשם כך פורסם ב-2025 תיקון 1 ל-ISO 16140-3, המוסיף פרוטוקול ייעודי לאימות (verification) של שיטות מאומתות לזיהוי מיקרואורגניזמים. ההבדל בין validation ל-verification מוסבר באימות ווריפיקציה של שיטות לפי ISO 16140.

מה MALDI-TOF אינו יכול לעשות

• הוא אינו מזהה בדגימה. הוא זקוק לבידוד טהור. הוא אינו מחליף את ההעשרה ואת הסינון באמצעות PCR; הוא נכנס לאחר מכן.
• הוא מזהה רק את מה שנמצא במאגר. Singhal ושותפיו מזכירים שבידוד חדש ניתן לזיהוי רק אם המאגר מכיל את פרופילי הייחוס המתאימים. מיקרואורגניזם מקלקל נדיר עלול להישאר ללא זיהוי.
• יש לו קושי עם מינים קרובים מאוד. אותה סקירה מביאה כדוגמאות שהוא אינו מבחין באופן אמין בין Escherichia coli ל-Shigella, ולא בין Streptococcus pneumoniae ל-S. mitis, בלי בדיקות נוספות.
• הוא אינו מחליף את הטיפוס השגרתי. זיהוי בידוד כ-Salmonella אינו אומר לאיזה סרוטיפ הוא שייך. סרוטיפיזציה נותרת שלב נפרד, ולקישור בין מקרים בהתפרצות התקן הוא ריצוף גנום שלם (WGS).

היכן הוא תורם יותר במפעל מזון

מלבד אישור פתוגנים, MALDI-TOF שימושי במשימות שבהן מצטברים בידודים רבים והשאלה היא "מה זה":

• קלקול: זיהוי השמר או החיידק שבודד מאריזה תפוחה או ממשקה שהשתנה מכוון את חיפוש שורש הבעיה הרבה יותר מספירה כוללת, כפי שראינו במיקרואורגניזמים מקלקלים.
• ניטור סביבתי: זיהוי הבידודים החוזרים מאותה נקודה במפעל מאפשר לראות אם חוזר אותו מין או שכל ממצא שונה.
• אוספי זנים פנימיים: שמירה על רישום של המינים שנמצאו במפעל מסייעת להשוות ממצאים לאורך זמן.

Singhal ושותפיו מצטטים מחקר שבו זיהוי באמצעות MALDI-TOF עלה כמה דולרים בודדים לדגימה, לעומת כ-100 דולר של ריצוף הגן 16S rRNA, עם תוצאות בדקות או בשעות במקום 24 עד 48 שעות של השיטות הקונבנציונליות. עלות המכשיר גבוהה, ולכן הטכניקה מתרכזת בדרך כלל במעבדות בנפח גבוה או במעבדות שירות, המציעות אותה למפעלים שאין להם את המכשיר.

MALDI-TOF, PCR ו-WGS: שלוש שאלות שונות

טכניקות אלה משלימות זו את זו משום שהן עונות על שאלות שונות. ה-PCR עונה אם החומר הגנטי של מיקרואורגניזם נמצא בדגימה או בהעשרה. MALDI-TOF עונה לאיזה מין שייכת מושבה שכבר בודדה. ה-WGS עונה אם שני בידודים הם, הלכה למעשה, אותו זן. מעבדה מאורגנת היטב משתמשת בכל אחת בנקודה בזרימה שבה תשובתה היא זו הנדרשת.